【摘要】：研究背景化療耐藥在口腔惡性腫瘤的臨床治療中較為常見,也是導(dǎo)致患者治療失敗、預(yù)后較差的重要原因之一。近年來,已有大量研究發(fā)現(xiàn)腫瘤低氧微環(huán)境中低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)的存在可以導(dǎo)致腫瘤化療耐藥。此外腫瘤微環(huán)境另一特征是慢性炎癥,而核因子κB(NF-κB)作為炎癥應(yīng)答中的重要轉(zhuǎn)錄因子,已被證實(shí)與HIF-1α之間存在交互調(diào)控效應(yīng)。我們的前期研究以及部分研究者已發(fā)現(xiàn)NF-κB位于HIF-1α啟動(dòng)子的上游,具有調(diào)控HIF-1α轉(zhuǎn)錄的功能。二甲雙胍(Metformin)作為廣泛應(yīng)用的降血糖藥物,同時(shí)眾多的研究者發(fā)現(xiàn)其對多種腫瘤發(fā)揮抗腫瘤作用,但是其中抗腫瘤的機(jī)制并不十分清楚。本研究中我們分別通過體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)去探究二甲雙胍聯(lián)合化療藥物順鉑治療口腔鱗癌的效果及可能機(jī)制,為口腔腫瘤的臨床治療提供更多可能。研究目的探究Metformin能否通過NF-κB/HIF-1α增強(qiáng)口腔鱗癌對順鉑的化療敏感性。研究方法1.將順鉑以濃度梯度稀釋后處理口腔鱗癌細(xì)胞系HSC3、SCC3、TCA8113,分別在常氧和低氧條件下培養(yǎng)48h,應(yīng)用MTT檢測口腔鱗癌細(xì)胞系對順鉑治療的半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50);2.分別將三種口腔鱗癌細(xì)胞系在低氧和常氧條件下培養(yǎng)48h后,通過western blot方法檢測三種口腔鱗癌細(xì)胞系中HIF-1α表達(dá)情況,再應(yīng)用干擾RNA技術(shù)抑制HIF-1α表達(dá)后,通過MTT法檢測口腔鱗癌細(xì)胞對于順鉑治療的IC50值;3.聯(lián)合應(yīng)用Metformin和順鉑處理三種口腔鱗癌細(xì)胞系,分別在常氧和低氧條件下培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞,通過流式方法檢測腫瘤細(xì)胞在常氧和低氧培養(yǎng)下細(xì)胞的凋亡變化情況;4.應(yīng)用metformin處理三種口腔鱗癌細(xì)胞系,分別在常氧和低氧條件下培養(yǎng)24后,通過免疫熒光方法檢測Metformin對HIF-1α和NF-κB亞基p65表達(dá)及核轉(zhuǎn)位的作用;5.動(dòng)物實(shí)驗(yàn):飼養(yǎng)裸鼠共16只,分4組,每組4只。應(yīng)用口腔鱗癌細(xì)胞系HSC3建立裸鼠移植瘤模型,4組裸鼠依次采用Metformin、cisplatin、Metformin+ cisplatin方法處理,最后處死裸鼠,收集瘤體組織,免疫組化檢測NF-κB/HIF-1α蛋白表達(dá)變化,TUNEL方法檢測腫瘤細(xì)胞凋亡情況。研究結(jié)果1.應(yīng)用順鉑處理三種口腔鱗癌細(xì)胞系HSC3、SCC3、TCA8113,低氧和常氧條件下培養(yǎng)48h后,結(jié)果顯示.IC50值在低氧條件下顯著高于常氧狀態(tài);2.低氧條件下培養(yǎng)口腔鱗癌細(xì)胞48h后,western blot方法檢測顯示三種細(xì)胞HIF-1α表達(dá)均明顯升高,采用siRNA干擾技術(shù)抑制HIF-1α表達(dá)后,口腔鱗癌細(xì)胞對順鉑的IC50值較對照組均降低;3.聯(lián)合應(yīng)用Metformin和順鉑處理三種口腔鱗癌細(xì)胞系,分別在常氧和低氧條件下培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)方法檢測結(jié)果顯示三種口腔鱗癌細(xì)胞在低氧培養(yǎng)條件下的凋亡比例較單純順鉑處理組明顯升高;4.分別在常氧和低氧條件下采用Metformin處理腫瘤細(xì)胞后可以明顯抑制HIF-1α和p65核轉(zhuǎn)位變化;5.裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,聯(lián)合應(yīng)用Metformin和順鉑處理裸鼠后可以顯著抑制HIF-1α,GLUT-1,Bcl-2,p-p65表達(dá),并且腫瘤細(xì)胞的凋亡比例顯著增加,即顯示了Metformin增強(qiáng)順鉑的治療作用。研究結(jié)論在低氧條件下Metformin可以通過抑制NF-κB/HIF-1α信號(hào)增強(qiáng)口腔鱗癌細(xì)胞對順鉑化療的敏感性,有望成為臨床上靶向治療的新途徑。
【圖文】：

＊；邋ＰＣ０．０１＊＊邋；邋ＰＣ０．００１料＊0逡逑４實(shí)驗(yàn)結(jié)果逡逑４．１邋口腔鱗癌低氧微環(huán)境對順鈾化療敏感性的研宄逡逑ＯＳＣＣ細(xì)胞系ＨＳＣ３、ＳＣＣ３、ＴＣＡ８１１３分別在常氧（２０％0２）和低氧（１２）環(huán)境下培養(yǎng)４８ｈ后測定半數(shù)抑制濃度．從結(jié)果可見三種細(xì)胞系低氧培養(yǎng)后５０均顯著高于對照組即常氧培養(yǎng)組（ＴＣＡ８１１３：邋ｐ＜０．０１，邋ＨＳＣ３、ＳＣＣ３邋：ｐ＜０．００１）鱗癌細(xì)胞系ＨＳＣ３、ＳＣＣ３、ＴＣＡ８１１３的ＩＣ５值。邐（單位：ｐＭ對照組（常氧）邐ｐ0２ｌ％逡逑１１．２６±０．９１邐１７．４４士１．１０逡逑５．７３±０．４２邐９．８６±１．５５逡逑３邐７．５４±０．８８邐９．８３±１．３０逡逑

培養(yǎng)４８ｈ，提取各組細(xì)胞培養(yǎng)后的ｍＲＮＡ及蛋白，分別使用ｑ－ＰＣＲ與Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ逡逑方法檢測低氧環(huán)境下ＨＩＦ－ｌａ表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染ｓｉ－ＨＩＦ－ｌａ后ＨＳＣ３、ＳＣＣ３、逡逑ＴＣＡ８１１３細(xì)胞在低氧條件下，，ｍＲＮＡ水平明顯降低（圖２Ａ），并且其ＨＩＦ－ｌｃｔ逡逑蛋白水平明顯降低（圖２Ｂ）。逡逑Ｉ邐灥邋ＯＣＴＲＯＩ逡逑ｍ邐＾邐＾邐＿貧躺。逡逑Ｉ邋１0｜邋ｆｌ邐，丨■逡逑ｈ：！ｂ逡逑＾逡逑＃邐＃邐＾逡逑Ｂ邐ＨＳＣ３邐ＳＣＣ３邋ＴＣＡ８１１３逡逑ＮＣ邋ｓｉＲＮＡ邋ＮＣ邋ｓｉＳＭＡ邋ＭＣ邋ｓｉＲＮＡ逡逑…ｗ邋“逡逑ｐ－８Ｃｌｉｆｌ邋？ＭＢＭａａｒ邋ｎｍｍｍｉｍｉｍ－逡逑圖２示：將ｓｉ－ＨＩＦ－１邋ａ轉(zhuǎn)染口腔鱗癌細(xì)胞４８ｈ后置于１邋％０２和常氧條件下培養(yǎng)４８ｈ，逡逑通過ｑＰＣＲ與Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ方法檢測細(xì)胞ＨＩＦ－ｌｏｔ表達(dá)情況。Ａ圖示ｑＰＣＲ結(jié)果；逡逑Ｂ圖為ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ結(jié)果。逡逑１．４．３邋ＨＩＦ－ｌｃｔ在低氧微環(huán)境中對ＯＳＣＣ順鉑化療敏感性的影響逡逑為了探究ＨＩＦ－ｌｏ（在ＯＳＣＣ細(xì)胞適應(yīng)低氧微環(huán)境中所起到作用，我們將低表逡逑達(dá)ＨＩＦ－ｌａ的ＯＳＣＣ細(xì)胞系ＨＳＣ３、ＳＣＣ３、ＴＣＡ８１１３接種至９６孔板中，放于含逡逑１％0２的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)４８ｈ后，通過ＭＴＴ方法檢測ＯＳＣＣ細(xì)胞系的ＩＣ５0值。結(jié)逡逑果顯示正常細(xì)胞組ＨＳＣ３、ＳＣＣ３、ＴＣＡ８１１３的ＩＣ５Ｄ值明顯高于ＨＩＦ－ｌａ低表達(dá)組逡逑腫瘤細(xì)胞的ＩＣ５0值（Ｐ＜０．０５）。同時(shí)我們通過ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ方法測定了邋ＨＩＦ－１的耙基逡逑因Ｂｃｌ－２、ＧＬＵＴ－１及ＨＩＦ－ｌａ本身的蛋白表達(dá)改變情況。結(jié)果提示在
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R739.8


本文編號(hào)：2549650