發(fā)布時間：2019-10-13 05:20

【摘要】：胃癌是胃粘膜上皮細(xì)胞最為常見的惡性腫瘤之一,在發(fā)展中國家尤其是在中國,胃癌的發(fā)病率和死亡率均居世界前列。盡管外科手術(shù)仍被認(rèn)為是胃癌治療的最主要手段,但胃癌患者5年生存率仍不足20%。因此,除了傳統(tǒng)的治療方法,探索胃癌發(fā)生的潛在分子機(jī)制并尋找有效的靶向藥物已成為胃癌治療的關(guān)鍵問題。越來越多的研究發(fā)現(xiàn),許多小分子基因在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起著很重要的作用,如MicroRNAs (miRNAs)、環(huán)RNA (circular RNA)、 RNA結(jié)合蛋白(RBPs)、癌基因等的異常表達(dá)都有可能引起細(xì)胞生物學(xué)行為發(fā)生變化,導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。目前這些小分子基因的功能以及與此相關(guān)的基因調(diào)控已成為腫瘤研究的重點。miRNAs長度約為20～25 nt,是一類由內(nèi)源基因編碼的單鏈RNA,由約70-90nt具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶剪切加工后生成,miRNAs本身不翻譯成蛋白質(zhì),在不同生物中主要影響轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá),從而調(diào)節(jié)細(xì)胞多種生物學(xué)過程。研究發(fā)現(xiàn),miRNAs在多種癌癥中存在差異表達(dá),這些miRNAs可能起到腫瘤癌基因或抑癌基因的作用。原癌基因由于易位、倒位、突變等原因被激活后成為癌基因,所編碼的蛋白質(zhì)就可能會出現(xiàn)表達(dá)異常從而導(dǎo)致細(xì)胞癌變和腫瘤發(fā)生。抑癌基因的失活和沉默與腫瘤的發(fā)生也有著密不可分的關(guān)系,當(dāng)抑癌基因本身出現(xiàn)分子生物學(xué)的改變,如基因的突變、易位和缺失等,都可能會造成抑癌基因表達(dá)失調(diào)、基因失活甚至腫瘤發(fā)生。因此,通過對原癌基因和抑癌基因的深入調(diào)查研究有助于為腫瘤的預(yù)防和治療提供新的思路和方法。細(xì)胞中還存在一類RNA結(jié)合蛋白(RBPs)與mRNA有高度親和性,通過與mRNA順式調(diào)控元件直接或間接作用促進(jìn)mRNA的脫腺苷化和降解。在一些和細(xì)胞增殖、分化、周期和凋亡相關(guān)的信號通路中,RBPs往往是一個關(guān)鍵參與因子,在正常細(xì)胞中,這些節(jié)點可以修復(fù)染色體復(fù)制過程中出現(xiàn)的基因異常,但由于某種原因,RBPs表達(dá)失調(diào),就會導(dǎo)致癌基因及其相關(guān)炎癥因子mRNA的不穩(wěn)定,從而使腫瘤發(fā)生。本文通過深入開展以上研究,對闡明胃癌發(fā)生發(fā)展的功能機(jī)制研究和臨床診斷具有重要意義。本文主要內(nèi)容如下：1.探討miR-760對胃癌細(xì)胞系MGC-803增殖、遷移和侵襲的影響Real-time PCR分析50例胃癌組織(C)及其癌旁組織(N)中miR-760的表達(dá)水平,用pcDNA3.1載體構(gòu)建過表達(dá)miR-760的重組質(zhì)粒(pcDNA-miR-760),實現(xiàn)miR-760在胃癌細(xì)胞MGC-803細(xì)胞中的過表達(dá)。分別用CCK-8法、Transwell和劃痕實驗檢測MGC-803細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力。結(jié)果顯示,與癌旁組織相比,有36例(72%)胃癌組織中出現(xiàn)miR-760的表達(dá)下調(diào),miR-760表達(dá)上調(diào)后能顯著抑制胃癌MGC-803細(xì)胞的遷移和侵襲能力(P0.05),但對細(xì)胞增殖影響不大。說明miR-760的表達(dá)下調(diào)可能與胃癌的進(jìn)展有關(guān),過表達(dá)miR-760可以抑制MGC-803細(xì)胞的遷移和侵襲。2.探討Eaf2基因?qū)ξ赴┘?xì)胞系MGC-803增殖、遷移和侵襲的影響Real-time PCR分析50例胃癌組織(C)及其癌旁(N)中11-19賴氨酸富集白血病(eleven-nineteen lysine-rich leukemia, ELL)基因相關(guān)因子2(ELL-associatedfactor 2, Eaf2)的表達(dá)水平；用pcDNA3.1載體構(gòu)建過表達(dá)Eaf2的重組質(zhì)粒(pcDNA-Eaf2),實現(xiàn)Eaf2在MGC-803細(xì)胞中的過表達(dá),使用CCK8、劃痕實驗和Transwell分別檢測細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力。結(jié)果顯示與癌旁組織相比,有42例(84%)胃癌組織中出現(xiàn)Eaf2的表達(dá)下調(diào)；Eaf2表達(dá)上調(diào)能顯著抑制MGC-803細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力(P0.05)。說明Eaf2可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展中作為抑癌基因發(fā)揮作用。3.RBPs參與的pre-mRNA的選擇性剪接在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用有證據(jù)表明,剪接機(jī)制在腫瘤發(fā)生過程中常常失調(diào),而癌細(xì)胞更傾向于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的同源異構(gòu)體從而促進(jìn)細(xì)胞的生長和發(fā)育。RNA結(jié)合蛋白QKI-5在人類腫瘤和腫瘤細(xì)胞系中作為可變剪接的一個主要調(diào)節(jié)子,但其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)作用和調(diào)節(jié)機(jī)制還不是很清楚。在本實驗中,我們證明了下調(diào)QKI-5的表達(dá)與胃癌患者的pTNM分期和pM分期有一定關(guān)系。再次導(dǎo)入QKI-5能抑制體內(nèi)外細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,可能是因為QKI-5改變了macroH2A1前體mRNA的可變剪接方式而導(dǎo)致macroH2A1.1同源異構(gòu)體的積累。此外,QKI-5能夠通過促進(jìn)macroH2A1.1的可變剪接抑制CCNL1的表達(dá)。因此,本實驗為胃癌的發(fā)生確定了一個新的調(diào)節(jié)機(jī)制,為胃癌的診斷和治療提供了一個新的策略。
【圖文】：

圖１．３胃癌Ｂｏｒｒｍａｒｍ分型［１拍］逡逑Ｆｉｇ．邋１．３邋Ｂｏｒｒｍａｎｎ邋ｔｙｐｅ邋ｏｆ邋ｇａｓｔｒｉｃ邋ｃａｎｃｅｒ逡逑胃癌的治療方法逡逑胃癌治療的方法很多，主要包括ｔｉｗｉ；逡逑（１）早巧胃癌：內(nèi)鏡粘膜切除術(shù)巧ＭＲ），內(nèi)鏡粘膜下剝離術(shù)巧ＳＤ）和育癌口）晚期胃癌：首選手術(shù)治療，對于無法手術(shù)切除的晚期胃癌主要有化療，祀向治巧，，放化療聯(lián)合治療和腹腔灌注化療。逡逑胃癌的研究現(xiàn)狀逡逑胃癌的發(fā)生除了Ｗ上環(huán)境、遺傳、身體因素外，在表觀遺傳學(xué)方面的改變非常重要的角色。環(huán)氧合酶ＣＯＸ－２在大部分胃體腺癌及少部分貴口腺癌達(dá)上調(diào)，其異常表達(dá)與腫瘤的大小和轉(zhuǎn)移關(guān)系巧關(guān)【１８４］。微衛(wèi)星不穩(wěn)ｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ邋ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ＭＳＩ）在胃癌的發(fā)生發(fā)展中與許多細(xì)胞周期和細(xì)胞調(diào)亡

２．２．４構(gòu)建ｍｉＲ－７６０過表達(dá)重組質(zhì)粒逡逑通過分析ｍｉＲ－７６０核巧酸序列和引物特征，本實驗選用表達(dá)載體ｐｃＤＮＡ，其結(jié)逡逑構(gòu)如圖２．２所示，表達(dá)載體的克隆位點上游有一段融合表達(dá)標(biāo)簽（Ｈｉｓ－Ｔａｇ標(biāo)簽）、逡逑ｐｃＤＮＡ為氨韋抗性。逡逑０邐％邋ｍ逡逑Ｕ邐％邋您，；Ｈ逡逑折ｃＤＮＡＧ／ＶＳ－Ｈｉｓｌ邋壚，卻園逡逑１邐ｇＡＢＣ邋Ｉ邋媂，Ｖ邋Ｍ逡逑５．１邋ｋｂ邐ＮＯＮ邋卻姦逡逑每Ｗ邐分栜Ｉ＂．園逡逑懿邋Ｉ逡逑Ｐｍｅ邋＼逡逑圖２．２ｐｃＤＮＡ克隆載體結(jié)構(gòu)圖逡逑Ｆｉｇ．邋２．２邋Ｔｈｅ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｐｃＤＮＡ邋ｖｅｃ化ｒ逡逑注：本研究中選用的兩個跨切位點由綠色互角符號標(biāo)注，分別為ＥｃｏＲｌ和Ｎｏｔｌ逡逑（１）邋ＷＭＧＣ－８０３細(xì)胞提取的ＲＮＡ反轉(zhuǎn)錄得到的ｃＤＮＡ為模板，進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增逡逑反應(yīng)，ＰＣ氏反應(yīng)體系和條件如下：逡逑２５逡逑
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2548502