【摘要】：研究背景：乳腺癌已成為全球第一高發(fā)的女性惡性腫瘤和女性癌癥相關死亡的首要原因,過去30年中在我國的各大城市以及農(nóng)村地區(qū)也均呈現(xiàn)顯著增長,作為總人口占據(jù)世界五分之一的第一人口大國,我國有著極其龐大的乳腺癌患病人群。伴隨著醫(yī)學科學技術的不斷進步,人們在乳腺癌的基礎轉化研究和臨床治療方面也取得了很大的進展,目前乳腺癌治療即將步入“精準醫(yī)療”時代。但是應該看到的是,多年來乳腺癌的總體生存率并未得到顯著提高。乳腺癌發(fā)生遠處侵襲、轉移是導致患者預后較差、死亡率升高的重要因素。從分子生物學角度了解乳腺癌發(fā)生發(fā)展的具體機制以及發(fā)生浸潤轉移的原因、尋求乳腺癌惡性轉化的靶點及開發(fā)靶向性治療藥物是當前研究的熱點。近年來,HMGB1 (high mobility group box chromosomal protein 1, HMGB1)對腫瘤生物學行為的影響及機制逐漸受到眾多研究者的關注。HMGB1是一種在真核生物細胞中普遍表達且進化過程中高度保守的非組蛋白染色體核蛋白。多年來對HMGB1的研究揭示,其與惡性腫瘤的不斷增殖、抑制細胞凋亡、促進腫瘤新生血管生成、發(fā)生侵襲和遠處轉移等多種生物學行為緊密相關,參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲和遠處轉移全過程并發(fā)揮了重要作用,目前已成為腫瘤預防和診治研究熱點,已有多篇文獻報道其在多種惡性腫瘤中的表達情況并對其作用機制進行了探討,但對于HMGB1與乳腺癌診治相關研究國內外報道相對較少,抑制或上調HMGB1基因表達會對乳腺癌細胞生物學行為造成哪些影響,其在疾病發(fā)生和進展過程中所起的具體作用和涉及到哪些信號通路仍不十分清楚。我們的研究旨在通過檢測HMGB1在乳腺癌組織及血清中的表達情況以及觀察抑制或上調HMGB1表達會對人乳腺癌MDA-MB-231細胞株生物學行為造成哪些影響,并分析其影響機制,從而初步探討HMGB1在乳腺癌疾病發(fā)生發(fā)展、侵襲轉移過程中的作用。目的：(1)分別采用免疫組織化學法(IHC)和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測乳腺癌患者組織及血清中HMGB1表達情況,探討其表達與乳腺癌臨床病理特征的關系及其在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展及浸潤轉移中的作用機制。(2)觀察小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制或下調HMGB1基因表達后對人乳腺癌細胞株MDA-MB-231細胞生物學行為的影響如何。(3)觀察重組HMGB1(rHMGB1)刺激人乳腺癌細胞MDA-MB-231后對細胞增殖、侵襲等生物學行為的影響及相關基因、蛋白的變化情況并初步探討其可能的下游信號通路。方法：(1)采用IHC法分別檢測]MGBl在乳腺癌組織、癌旁正常乳腺對照組織以及乳腺良性疾病對照組中的表達水平；采用ELISA法分別檢測相對應乳腺癌組、乳腺良性疾病對照組患者血清中HMGB1的表達水平,并統(tǒng)計學分析組織及血清HMGB1表達水平相關性及其與臨床常用病理學指標之間的關系。(2)設計并化學合成針對HMGB1的3對siRNA分子序列(siRNA H1、siRNA H2、siRNA H3),同時設空白對照組及陰性siRNA對照組。首先采用脂質體法將siRNA瞬時轉染MDA-MB-231細胞,然后通過RT-PCR和Western blot方法檢測HMGB1基因和蛋白表達水平的變化并記錄各siRNA的干擾效果；從中選擇出抑制作用最強的一組進入后續(xù)細胞生物學行為影響研究,分別采用噻唑藍比色法(MTT)、流式細胞術(FCM)及Transwell法檢測轉染HMGBl-s iRNA后MDA-MB-231細胞在增殖、周期、凋亡以及侵襲力等方面生物學行為的變化。(3)20ng/ml重組HMGB1(rHMGBl)及其抗體刺激MDA-MB-231細胞24 h,采用MTT法檢測細胞增殖變化、Transwell法檢測細胞侵襲力變化；逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)及Western blot法檢測其對MDA-MB-231細胞核因子NF-κB/p65 (nuclear factor kappa B/p65, NF-κB/p65)、基質金屬蛋白酶(MMP)-9 mRNA和蛋白表達的影響。結果：(1)HMGB1在乳腺癌組織中表達水平明顯高于相對應癌旁正常乳腺組織及乳腺良性疾病組織,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)；組織中HMGB1的表達水平與腫瘤細胞分化高低、淋巴結是否轉移、腫瘤TNM分期等臨床常用參數(shù)密切相關,其差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)；血清HMGB1含量在乳腺癌組亦明顯高于乳腺良性疾病組和正常志愿者對照組(P0.05),但乳腺癌患者血清HMGB1表達水平與臨床常用參數(shù)并無相關,且腫瘤組織HMGB1高表達組與低表達組相比較,兩組血清HMGB1水平并無統(tǒng)計學差別(P0.05)。(2)3對特異性HMGBl-siRNAs轉染MDA-MB-231細胞后,HMGB1mRNA相對表達量分別為0.448±0.045、1.148±0.038、1.118±0.078,較空白對照組的1.393±0.070明顯減少(t值分別為25.393、6.878和5.867,P值均0.01)；3對特異性HMGB1-siRNAs轉染MDA-MB-231細胞后,HMGB1蛋白相對表達量分別為0.143±0.040、0.353±0.032、0.394±0.019,較空白對照組的0.600±0.064明顯減少(t值分別為13.540、7.718和6.900,P值均0.01),其中siRNA H1組抑制率約為70%,明顯高于其他組。與空白對照組相比,MDA-MB-231細胞增殖能力在轉染siRNA H1后72h、96h、120h時受到顯著抑制,t值分別為7.130、30.972、25.679,P值均0.01,MTT檢測結果顯示：siRNA H1組細胞增殖率明顯低于空白對照組及陰性siRNA對照組(P0.01)；細胞周期分布結果顯示：siRNA H1組G0/G1期細胞所占比例明顯高于對照組(P0.01),而S期和G2/M期細胞所占比例則顯著下降(P0.01)；細胞凋亡結果顯示：siRNA H1組早期、中晚期細胞凋亡率及總凋亡率均顯著高于對照組(P 0.01); Transwell法結果顯示,siRNA-H1組細胞侵襲能力與空白對照組和陰性siRNA對照組相比有明顯下降(P0.01)。(3)MTT結果表明,MDA-MB-231細胞空白對照組與rHMGBl組、rHMGBl-抗體組、rHMGBl+IgG組、rHMGBl+rHMGB1-抗體組的吸光度分別為：0.266±0.038、0.712±0.039、0.283±0.030、0.709±0.022、0.201±0.027：重組HMGB1組MDA-MB-231細胞增殖能力明顯強于空白對照組(P0.05)；20ng/mL重組HMGB1作用MDA-MB-231細胞24h后,NF-κB/p65及MMP-9mRNA相對表達量分別為1.244±0.115、1.440±0.081,較MDA-MB-231細胞空白對照組NF-κB/p65及MMP-9mRNA相對表達量為0.537±0.026、0.774±0.053顯著增高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)；重組HMGB1作用MDA-MB-231細胞24h后,NF-κB/p65、MMP-9蛋白相對含量分別為0.497±0.069、0.383±0.017,較空白對照組NF-κB/p65、MMP-9蛋白的相對含量0.402±0.050、0.294±0.014均明顯增高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。rHMGBl作用MDA-MB-231細胞24 h后,Transwell實驗結果顯示,重組HMGB1組透膜細胞數(shù)為379±32個,相對應空白對照組透膜細胞數(shù)則僅為204±26個,重組HMGB1組MDA-MB-231細胞侵襲力明顯增強,兩組差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論：(1)乳腺癌患者腫瘤組織以及血清中HMGB1均呈現(xiàn)高表達水平,且組織中表達水平與細胞分化程度高低、淋巴結有無轉移、腫瘤TNM分期等臨床常用參數(shù)呈密切相關,提示HMGB1作為輔助指標,在乳腺癌診斷、預后判斷以及乳腺癌診斷篩查中具有一定價值。(2)HMGB1-siRNA技術可有效抑制HMGB1表達并對MDA-MB-231細胞的增殖、凋亡及侵襲力等生物學行為造成影響,可進一步探討將HMGB1作為治療靶點的可行性。(3)重組HMGB1組與空白對照組比較,可明顯增強MDA-MB-231細胞增殖、侵襲能力,而HMGB1抗體可有效拮抗外源性HMGB1的作用。HMGB1可能是通過上調NF-κB/p65基因和蛋白的表達水平,進而激活MMP-9等下游相關信號通路,其詳細作用機制尚待進一步研究。
【圖文】：

指標邐乳腺癌邐分化程度邐淋己結轉移邐ＴＮＭ分期逡逑敏感性邐７３．２１％（４１／５６）邐８６．８４％（３３／３８）邐８８．００％（２２／巧）８９．４７％（１７／１９）逡逑特異性邐８４．００％（２１／巧）邐５５．５５％（１０／１８）邐３８．邋７１％（１２／３１）邐３５．邋１４％（１３／３７）逡逑陽性預測值邐９１．邋１１％（４１／４５）邐８０．４９％（３３＾Ｕ邐５３．６６％（２２／４１）邐４１．４６％（１７／４１）逡逑陰牲預測值邐５８．邋３３％（２１／３６）邐６６．６７％（１０／１５）撕．００％（１２／：１５）邐８６．６７％（口／１５）逡逑表１－４：各姐血清ＨＭＧＢ１含量逡逑分組邐ｎ邐ｓＨＭＧＢｌ邋含量（ｎｇ／ｍｌ）逡逑乳腺癌組邐５６邐４．６４邋＋邋２．５０＊逡逑乳腺良性疾病組邐２５邐１．３２邋＋邋０．６８逡逑正常志愿者沮邐３０邐１．邋：３６±０．７５逡逑＊／＜化０５邋ＶＳ良性疾病組及正常志愿者對照姐逡逑

１：空白對照姐；２：陰性ｓｉＲＮＡ對照組；３：邋ｓｉＫＮＡ邋ＨＩ組；４：邋ｓ巧ＮＡ邋Ｈ２}D；５：邋ｓ：ｉＲＮＡ組；ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞轉染ＨＭＧＢｌ邋ｓｉＲＮＡｓ邋７２ｈ后進行Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測ＨＭ她１蛋白水平，逡逑ＷＧＡＰＤＨ為內參，計算蛋白條帶與ＧＡＰＤＨ蛋白條帶的相對強度，結果表明，，與陰性ＳｉＲＮ及空白對照組相比，R*邸１邋ｓｉＲＮＡｓ明顯下調R*ＧＢ１蛋白表達。＊：與空白對照組比較，〈０．邋０１邋（Ｘ邋＋邋■？邋，邋１１卻）逡逑表２－９：邋ｓｉＲＮＡ對ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞增殖的抑制作用（ｘ±＿ｙ，ｎ＝３）組別邐２４ｈ邐４加邐７２ｈ邐９化邐１２０ｈ逡逑空白對照邐０．３３８±０．０２４邐０．６０４邋±０．０６７邐０．６７１＋０．０２８邐１．３５４＋０．０４３邐１．１５５＋０．０５１逡逑陰性邋ＳｉＲＮＡ邐０．３７６邋＋邋０．０２２邐０．５９０邋＋邋０．０３４邐０．６８８＋０．０３２邐１．４４５＋０．０３６邐１．１３８＋０．０３６逡逑ＳｉＲＮＡ邋ＨＩ邐０．３５０邋＋邋０．０２７邐０．５１１＋０．０４８邐０．５０２＋０．０４５＊邐０．６５８邋±０．０２６＊邐０．５３０＋０．０１９＊逡逑＊；分別與空白對照姐及陰性ＳｉＲＮＡ巧比較，／＞＜０．０５逡逑
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 俞燕;謝岷;賀鈺磊;許望瓊;朱珊;曹勵之;;高遷移率族蛋白1對阿霉素誘導的白血病K562細胞凋亡的影響[J];癌癥;2008年09期

本文編號：2548279