【摘要】：目前在世界范圍內(nèi),肺癌已經(jīng)上升成為第一位高發(fā)的惡性腫瘤,發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢,但其5年生存率一直徘徊在15%～20%左右,療效亟待提高。放射治療作為肺癌主要的治療手段之一,在肺癌的綜合治療中占據(jù)重要地位,如何提高肺癌的輻射敏感性一直是腫瘤研究領域的熱點問題。肝激酶B1 (liver kinase B1,LKB1)基因?qū)儆阝}/鈣調(diào)蛋白激酶樣家族,據(jù)文獻報道,大約有33%的原發(fā)性肺腺癌患者和50%的肺腺癌細胞株存在LKB1基因突變。目前研究認為,LKB1基因通過多個信號通路對肺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等都起著重要作用,這些信號通路往往與p53和p21等腫瘤抑制因子發(fā)生相互關聯(lián),而p53和p21等都是輻射敏感相關因素。因此,我們提出LKB1對肺癌細胞可能具有輻射增敏作用的設想,并在前期構(gòu)建融合過表達質(zhì)粒pEGFP-LKB1在體外轉(zhuǎn)染LKB1缺失突變的A549、H460肺腺癌細胞株,進行了初步探索,結(jié)果顯示LKB1過表達能增加肺癌細胞的輻射敏感性,其機制可能與其抑制細胞增殖、減少照射后亞致死性損傷的修復和促進細胞周期再分布等方面有關。在前期工作基礎上,為進一步探討LKB1對肺腺癌的輻射增敏作用及其可能的機制,本研究構(gòu)建、篩選了攜帶增強型綠色熒光蛋白(enhancedgreen fluorescent portein, EGFP)標記的LKB1小干擾融合質(zhì)粒,以LKB1正常表達的人肺腺癌細胞株H1299和95-D為研究對象,觀察下調(diào)LKB1對肺腺癌細胞生物學行為及輻射敏感性的影響,并探討其可能的機制；另外,利用LKB1缺失突變的人肺腺癌細胞株H460構(gòu)建裸鼠肺癌皮下移植瘤模型,過表達LKB1并聯(lián)合照射,觀測腫瘤抑制情況,在體內(nèi)水平探討LKB1過表達對肺腺癌細胞輻射敏感性的影響。腫瘤放射治療后殘留的腫瘤細胞——即腫瘤輻射抗性細胞,其侵襲力和轉(zhuǎn)移活性增強,是腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移的主要來源。有研究顯示腫瘤輻射抗性細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)現(xiàn)象的發(fā)生和上調(diào)是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關鍵因素。我們的前期實驗表明,過表達LKB1后的肺腺癌A549和H460細胞,遷移能力變?nèi)?提示LKB1可能有抑制肺腺癌細胞浸潤和侵襲的作用。但LKB1是否能夠通過調(diào)控EMT來影響肺腺癌輻射抗性細胞浸潤侵襲及其可能的機制尚不十分清楚。前期我們針對LKB1缺失的肺腺癌A549構(gòu)建輻射抗性細胞株,并轉(zhuǎn)染LKB1過表達質(zhì)粒,結(jié)果顯示上調(diào)LKB1可抑制肺腺癌輻射抗性細胞EMT,減弱其侵襲遷移能力。為進一步探討LKB1對肺腺癌輻射抗性細胞EMT及遷移侵襲的調(diào)控作用,在前期工作基礎上,本研究構(gòu)建了LKB1正常表達的肺腺癌H1299輻射抗性細胞株,檢測其生物學特性；并下調(diào)LKB1,檢測細胞侵襲遷移能力的變化,觀察EMT標志蛋白的改變,并監(jiān)測LKB1下游效應分子SIK1和ZEB1蛋白水平的變化,探索LKB1基因?qū)Ψ蜗侔┹椛淇剐约毎鸈MT是否有調(diào)控作用及其可能的機制。本研究對提高肺癌細胞輻射敏感性有一定的現(xiàn)實意義和應用前景,為提高肺癌治療療效初步奠定理論和實驗基礎。本研究分兩部分進行。第一部分：LKB1對肺腺癌輻射增敏作用的研究：第二部分：LKB1調(diào)控肺腺癌輻射抗性細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究。第一部分：L1KB1對肺腺癌輻射增敏作用的研究目的：在體外,采用shRNA技術觀察下調(diào)LKB1對肺腺癌細胞生物學行為的影響及輻射增敏作用；構(gòu)建裸鼠肺腺癌移植瘤模型,探討LKB1在體情況下對肺腺癌輻射敏感性的影響。方法：構(gòu)建LKB1小干擾融合質(zhì)粒并鑒定,在體外轉(zhuǎn)染人肺腺癌H1299和95-D細胞,熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達, Western blot檢測LKB1蛋白的表達水平。CCK-8法、流式細胞術和劃痕實驗等方法檢測下調(diào)LKB1基因?qū)Ψ蜗侔┘毎鲋�、細胞周期分布、侵襲能力等生物學行為的影響。根據(jù)單擊多靶模型和線性二次模型,集落形成實驗繪制細胞存活曲線,計算D 0、Dq、α/β和輻射增敏比(sensitization enhancement ratio, SER)等放射生物學指標,檢測LKB1的輻射增敏作用；聯(lián)合射線照射,CCK-8法檢測細胞增殖、流式細胞術測定細胞周期分布以及Wentern blot檢測γ-H2AX、p-Chk2、p53口p21蛋白表達,探討LKB1可能的輻射增敏機制。構(gòu)建裸鼠肺腺癌H460皮下移植瘤模型,將荷瘤鼠隨機分為空載質(zhì)粒對照(pEGFP-Ctrl)組、過表達LKB1 (pEGFP-LKB1)組、照射+空載質(zhì)粒(IR+pEGFP-Ctrl)組和照射+過表達LKB1 (IR+pEGFP-LKB1)組共四組,結(jié)合射線照射,觀察腫瘤生長情況,分析其放射敏感性的差異；并對腫瘤標本進行HE染色,免疫組化染色和Western跡法檢測瘤組織LKB 1表達情況。結(jié)果：通過酶切鑒定和測序,證明融合質(zhì)粒成功構(gòu)建。在轉(zhuǎn)染LKB1小干擾融合質(zhì)粒后12、24、48、72 h,分別熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),24 h時綠色熒光蛋白表達最多；Western blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染24 h后,LKB1為干擾最佳。CCK-8法檢測顯示,下調(diào)LKB1后H1299和95-D細胞增殖活性增強(P0.05)；流式細胞術顯示,下調(diào)LKB1后H1299和95-D細胞G0/G1期和G2/M期細胞比例明顯減少,而S期細胞比例升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)；劃痕實驗檢測顯示,下調(diào)LKB1后H1299和95-D細胞遷移能力增強(P0.05)。集落形成實驗顯示,下調(diào)LKB1后H1299和95-D肺癌細胞集落形成率增高,Do和Dq增大,“p值變小,SER分別為0.809和0.735。聯(lián)合射線照射,CCK-8法檢測顯示,同一劑量照射下,干擾LKB1組的細胞存活率較對照組明顯增高(P0.05),照射劑量為8 Gy時差異最大；流式細胞術結(jié)果顯示,下調(diào)LKB1聯(lián)合照射后處于G0/G1期和G2/M期的細胞比例明顯減少,而S期細胞比例升高(P0.05),以8 Gy最為明顯：Wentern blot檢測結(jié)果顯示,下調(diào)LKB1聯(lián)合照射后γ-H2AX、p-Chk2和p21蛋白表達減低(P0.05),H1299細胞未檢測到p53蛋白表達,95-D細胞p53蛋白表達減低(P0.05)。體內(nèi)實驗顯示,pEGFP-LKB1組、IR+pEGFP-Ctrl組和IR+pEGFP-L B1組三組腫瘤生長都受到不同程度的抑制,IR+pEGFP-LKB1組瘤體積和瘤體重量均為最低,腫瘤生長最為緩慢,過表達LKB1與射線具有協(xié)同抑制腫瘤生長的作用(P0.05)；免疫組化染色和Western印跡法結(jié)果顯示pEGFP-LKB1組和IR+pEGFP-LKB1組瘤組織LKB1表達,其余兩組無LKB1表達。結(jié)論：(1) LKB1具有一定的抑癌作用,在體外干擾LKB1可以調(diào)控肺腺癌細胞增殖、周期分布和遷移能力。(2)LKB1可能具有輻射增敏作用,在體外干擾LKB1可以調(diào)控肺腺癌細胞的輻射敏感性；LKB1有可能通過調(diào)控p53及p21信號進而影響肺腺癌細胞輻射敏感性。(3)在體內(nèi)過表達LKB1有抑制裸鼠肺腺癌移植瘤生長的作用,并能夠增強其對輻射的敏感性。第二部分：LKB1調(diào)控肺腺癌輻射抗性細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究目的：在體外構(gòu)建H1299肺腺癌輻射抗性細胞株,檢測其增殖、凋亡、侵襲和遷移等生物學特性；干擾LKB1表達后,檢測細胞侵襲遷移能力改變以及LKB1、SIK1、 ZEB1、E-cadherin 和 Vimentin等蛋白表達的改變。方法：小劑量等分割照射法、亞致死量照射法和梯度遞增照射法優(yōu)化H1299肺腺癌輻射抗性細胞構(gòu)建方案,倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài),根據(jù)單擊多靶模型和線性二次模型,集落形成實驗繪制細胞存活曲線,計算D0、Dq和α/β等放射生物學指標,CCK-8法檢測肺腺癌輻射抗性細胞受照射后的增殖情況,流式細胞術檢測細胞凋亡,’Transwell實驗檢測侵襲和遷移能力,劃痕實驗檢測遷移能力,Western印跡法檢測EMT標志蛋白E-cadherin和Vimentin表達,Western印跡法檢測LKB1、SIK1 和ZEB1蛋白水平。在體外,LKB1小干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H1299肺腺癌輻射抗性細胞,Transwell實驗和劃痕實驗檢測細胞侵襲和遷移能力,Western印跡法檢測LKB1、SIK1、ZEB1、 E-cadherin 和 Vimentin蛋白水平。結(jié)果：梯度遞增照射法所得到的肺腺癌輻射細胞抗性較強,將其命名為H1299R,倒置相差顯微鏡下見細胞體積變大,細胞間距離增大,細胞的極性消失,向紡錘樣間質(zhì)細胞形態(tài)改變,其Do和Dq值增高,α/β比值降低,CCK-8法檢測結(jié)果顯示增殖能力增強(P0.05),流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)細胞凋亡減少(P0.05),Transwell和劃痕實驗顯示細胞侵襲遷移能力增強(P值均0.05)；Western印跡法檢測結(jié)果顯示E-cadherin表達量下調(diào),LKB1、SIK1蛋白水平降低,Vimentin及ZEB1蛋白水平增高(P值均0.05)。在體外,下調(diào)H1299R細胞LKB1后,Transwell實驗和劃痕實驗檢測顯示侵襲和遷移能力增強(P值均0.05),Western印跡法檢測顯示LKB1、SIK1和E-cadherin蛋白水平降低(P值均0.05),ZEB1 和 Vimentin蛋白表達水平升高(P值均0.05)。結(jié)論：(1)可采用梯度遞增照射法構(gòu)建肺腺癌輻射抗性細胞；肺腺癌輻射抗性細胞具有增殖活性增強,受照后細胞凋亡減少,EMT上調(diào),侵襲遷移能力增強等生物學特點。(2)下調(diào)LKB1可以使肺腺癌輻射抗性細胞EMT表型增強,侵襲和遷移能力增加,LKB1可能通過下游SIK1/ZEB1信號通路發(fā)揮其調(diào)控作用。
【圖文】：

邐山東大學博ｉ；學位論義邐逡逑附圖表逡逑１２邋ｈ邐＾邐４８ｈ邐７２ｈ逡逑ｉＭＨＩＷＭ逡逑■■■逡逑圖ｌ－ｌ轉(zhuǎn)染后不同時間肺癌細胞綠色英光蛋白表達情況（ｘｉｏｏ）逡逑注：Ｈ１２９９和９５－Ｄ細胞，分別在轉(zhuǎn)染１２、２４、４８、７２邋ｈ后，，

本文編號：2542872