【摘要】：背景與目的據(jù)報道2012年全球癌癥約新發(fā)1410萬例和死亡820萬例,其中胃癌發(fā)病率位居所有癌癥的第五位,死亡率則高居第三位。目前國際通行的胃癌診療方案為以手術(shù)切除為主的綜合性治療。有學(xué)者認為,進展期胃癌強調(diào)增加清掃范圍、聯(lián)合臟器切除等手術(shù)方式無法給患者帶來更多益處。而對于進展期患者傳統(tǒng)的手術(shù)治療及放化療等方法療效欠佳,患者5年生存率仍低于30%。故尋求包括腫瘤基因治療在內(nèi)的新的有確切療效的胃癌診療方案成為當務(wù)之急。研究證實,惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與抑癌基因的失活具有非常密切的關(guān)系。通過生物學(xué)技術(shù)及原理,將目的基因?qū)氲侥繕藧盒阅[瘤細胞內(nèi),以實現(xiàn)對惡性腫瘤細胞抑癌基因突變或缺失的逆轉(zhuǎn),達到腫瘤患者帶瘤生存期的延長甚至臨床痊愈,這為臨床腫瘤治療提供了新的方法和希望。本文將通過慢病毒感染技術(shù)、Western blot、軟瓊脂克隆形成試驗等方法檢測FGGY是否為候選胃癌特異性抑癌基因。一、檢測不同細胞系中FGGY蛋白的表達差異方法1、Western blot檢測胃正常黏膜細胞及其他來源正常細胞系中FGGY蛋白的表達差異2、Western blot檢測胃正常黏膜細胞及胃癌細胞系中FGGY蛋白的表達差異結(jié)果1、Western blot檢測胃正常黏膜細胞及其他正常細胞系中FGGY蛋白的表達差異Western blot結(jié)果顯示:GES-1、JB6、Ha Ca T、HIEC、CCD-18Co細胞系中FGGY蛋白呈高表達。2、Western blot檢測胃正常黏膜細胞及胃癌細胞系中FGGY蛋白的表達差異Western blot檢測結(jié)果提示:SGC7901、BGC803、MGC823、HGC27細胞系中FGGY蛋白呈低表達或不表達。二、上調(diào)FGGY的表達對胃癌細胞生長的影響方法1、構(gòu)建p CMV-FGGY過表達載體,送上海生工測序驗證。2、將p CMV-FGGY質(zhì)粒轉(zhuǎn)染低表達或不表達胃癌細胞株,以轉(zhuǎn)染p CMV-Mock為對照組,Western blot檢測轉(zhuǎn)染后FGGY蛋白過表達效率。3、軟瓊脂克隆形成試驗檢測過表達FGGY對胃癌細胞非錨定生長能力的影響。每種胃癌細胞均分為2組:p CMV-Mock組,p CMV-FGGY組,細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-14天,鏡下觀察細胞克隆的大小及數(shù)目的變化。結(jié)果1、胃癌細胞轉(zhuǎn)染p CMV-FGGY后,FGGY蛋白表達量顯著升高。2、發(fā)現(xiàn)過表達FGGY顯著抑制癌細胞的非錨定生長,克隆形成數(shù)顯著減少。三、沉默基因FGGY對EGF誘導(dǎo)的正常細胞轉(zhuǎn)化的影響方法1、設(shè)計FGGY sh RNA引物,做PCR得到片段,克隆到plko構(gòu)建FGGYsh RNA表達載體。2、將FGGY sh RNA表達載體通過慢病毒顆粒shmock和sh FGGY感染JB6細胞,通過嘌呤霉素篩選,建立FGGY沉默穩(wěn)定細胞株,Western blot檢測基因沉默后FGGY蛋白水平的變化。3、軟瓊脂克隆形成試驗檢測基因沉默F(xiàn)GGY對EGF誘導(dǎo)的細胞轉(zhuǎn)化的影響。結(jié)果1、基因沉默后,JB6細胞FGGY蛋白表達量顯著降低。2、發(fā)現(xiàn)下調(diào)FGGY顯著增強EGF誘導(dǎo)的細胞轉(zhuǎn)化,克隆形成時間提前,數(shù)量顯著增多,直徑顯著增大。結(jié)論1、細胞實驗證實FGGY基因抑制胃癌細胞的增殖,并對其侵襲、遷移能力有抑制作用。2、FGGY基因為一潛在抑癌基因,在胃癌的發(fā)生發(fā)展中有調(diào)節(jié)抑制作用,可能成為胃癌基因治療的一個潛在靶點。
【圖文】：

第一章 檢測不同細胞系中 FGGY 蛋白的表達差異避光條件下孵育 2-5min，利用凝膠成像分析儀獲取圖像。2 實驗結(jié)果2.1 不同來源的正常細胞系內(nèi) FGGY 蛋白的表達Western blot 結(jié)果表明（圖 1-1）FGGY 蛋白在胃正常黏膜細胞以及其他來源的正常細胞內(nèi)存在 FGGY 蛋白的表達。用 Image J 軟件進行各細胞間的條帶灰度值掃描后，結(jié)果顯示各種細胞內(nèi) FGGY 的表達存在差異。

灰度值掃描后，結(jié)果顯示各種細胞內(nèi) FGGY 的表達存在差異。圖 1-1 不同來源正常細胞系內(nèi) FGGY 蛋白的表達2.2 胃正常及胃癌細胞系內(nèi) FGGY 蛋白的表達Western blot 結(jié)果表明（圖 1-2）FGGY 蛋白在胃正常黏膜細胞內(nèi)存在 FGGY蛋白的表達且呈高表達狀態(tài)，但不同來源的胃癌細胞系呈低表達或不表達狀態(tài)。用 Image J 軟件進行各細胞條帶灰度值掃描后，對比各組得出絕對值較明顯的倍數(shù)差異,提示 FGGY 蛋白的缺失可能導(dǎo)致細胞增殖異常，出現(xiàn)惡性增殖進而導(dǎo)致胃癌的發(fā)生，，并且具有良好的器官特異性。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.2

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本文編號：2540203