【摘要】：第一部分miR-93在胃正常組織、胃癌組織及胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)及其與胃癌臨床病理學(xué)學(xué)特征之間的關(guān)系目的：檢測microRNA-93 (miR-93)在正常胃黏膜組織、胃癌組織及胃癌細(xì)胞株中的表達(dá),分析其表達(dá)與胃癌臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性。方法：收集20例正常胃黏膜標(biāo)本,60對配對的胃癌及癌旁標(biāo)本：購買6種胃癌細(xì)胞株(AGS、SGC-7901、MKN-28、MKN-45、HTB135及MKN-74)及永生化的胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1。利用qRT-PCR的方法檢測上述組織及細(xì)胞株中miR-93的表達(dá)水平：利用Mann-Whitney Test分析miR-93的表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理學(xué)參數(shù)之間的相關(guān)性。結(jié)果：qRT-PCR檢測結(jié)果表明,與正常的胃黏膜組織及癌旁組織相比(相對表達(dá)量分別為0.462±0.031、0.864±0.056),miR-93在胃癌組織中的表達(dá)量顯著升高(2.093±0.156);進一步分析表明其表達(dá)水平與腫瘤的大小、pTNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)相關(guān)：miR-93在腫瘤直徑大于4.5cm中的表達(dá)量(1.576±0.013)顯著高于腫瘤直徑小于4.5cm中的表達(dá)量(1.309±0.036)：在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)量(3.124±0.082)明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)量(1.871±0.054)；晚期胃癌(Ⅲ、Ⅳ期)組織中miR-93的表達(dá)量顯著高于其在正常胃黏膜組織及早期胃癌(Ⅰ、Ⅱ期)組織中的表達(dá)量,且其表達(dá)水平隨胃癌的演進而升高。此外,我們在胃癌細(xì)胞株中也得到了與胃癌組織中一致的結(jié)果,即與正常的胃黏膜細(xì)胞株GES-1比較(0.957±0.029),miR-93在胃癌細(xì)胞株AGS、SGC-7901、MKN-28、MKN-45、 MKN-74、HTB135中的表達(dá)也顯著升高(分別為2.053±0.081、2.353±0.137、2.792±0.186、3.051±0.115、3.126±0.227、3.611±0.194)。結(jié)論：miR-93在胃癌組織和胃癌細(xì)胞中高表達(dá),其表達(dá)的水平與胃癌的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及pTNM分期有關(guān),提示胃癌組織中高表達(dá)的miR-93可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。第二部分miR-93對胃癌細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響目的：在體外研究異常表達(dá)的miR-93對胃癌細(xì)胞增殖、周期、凋亡、侵襲及遷移能力的影響。方法：使用瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù),將miR-93 mimics、miR-93 inhibitor轉(zhuǎn)入相應(yīng)的胃癌細(xì)胞株AGS與HTB135中,引起miR-93在上述細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)或下調(diào),后分別采用CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)及Transwell實驗檢測異常表達(dá)的miR-93對胃癌細(xì)胞的增殖能力、周期分布、凋亡及侵襲與遷移能力的影響。結(jié)果：CCK-8實驗的結(jié)果表明,與陰性對照組(miR-NC)相比,AGS細(xì)胞在轉(zhuǎn)染miR-93 mimics后48、72及96h的增殖能力明顯增強：相反,轉(zhuǎn)染miR-93 inhibitor后48、72及96h, HTB135細(xì)胞的增殖能力受到顯著抑制。然而各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖能力在轉(zhuǎn)染后24h無明顯差異(P0.05)。流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染后48h,與miR-NC組比較,過表達(dá)miR-93使AGS細(xì)胞處于G0G1期的比例顯著減少,而位于S期的細(xì)胞比例明顯增加;相反,當(dāng)抑制miR-93的表達(dá)時,可使HTB135細(xì)胞周期阻滯于G0G1期。然而,上述處理對AGS及HTB135的凋亡功能無明顯影響。Transwell實驗結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染后24 h,與miR-NC組比較,轉(zhuǎn)染miR-93 mimics的AGS細(xì)胞其侵襲及遷移能力顯著提高;相反,轉(zhuǎn)染miR-93 inhibitor的HTB135細(xì)胞其侵襲及遷移能力受到明顯抑制。結(jié)論：體外功能學(xué)實驗表明miR-93的表達(dá)可促進胃癌細(xì)胞的增殖,侵襲及遷移能力,提示miR-93在胃癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮促癌基因的功能。第三部分miR-93調(diào)控胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的機制探討目的：預(yù)測并驗證miR-93在胃癌細(xì)胞中的靶基因,進一步闡明miR-93在胃癌中具體發(fā)揮促癌功能的分子學(xué)機制。方法：使用在線生物學(xué)信息軟件TargetScan與MiRbase預(yù)測miR-93的靶基因,通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒瀸Π谢蜻M行驗證。后使用Western blot和靶基因沉默實驗進一步明確miR-93通過對靶基因P21與PTEN的負(fù)調(diào)控而在胃癌細(xì)胞中發(fā)揮促癌功能。結(jié)果：生物信息學(xué)軟件預(yù)測P21及PTEN是miR-93的靶基因；雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示miR-93可顯著抑制野生型pGL3-P21-WT及pGL3-PTEN-WT的熒光素酶活性,而對其對突變體pGL3-P21-Mut及pGL3-PTEN-Mut的熒光素酶活性無顯著影響；Western blot結(jié)果進一步表明,miR-93可負(fù)調(diào)控P21及PTEN的表達(dá)；此外,靶基因沉默實驗結(jié)果顯示,抑制P21及PTEN的表達(dá)可促進胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力。結(jié)論：miR-93是通過(至少是部分通過)調(diào)控其靶基因P21及PTEN的表達(dá)而在胃癌細(xì)胞中發(fā)揮促癌功能,這或許為miR介導(dǎo)的胃癌靶向治療提供新的實驗依據(jù)及理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.2

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本文編號：2539114