【摘要】：目的①篩選胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS穩(wěn)定感染EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)后轉(zhuǎn)錄表達(dá)發(fā)生改變的特異基因,以及出現(xiàn)的特異基因結(jié)構(gòu)變化,如單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism,SNP)、可變剪切(alternative splicing,AS)、插入/缺失(insertion/deletion,Indel)等,并對AGS細(xì)胞系中EBV病毒基因的表達(dá)進(jìn)行分析。②選取轉(zhuǎn)錄組測序篩選出的由于EBV感染誘發(fā)的部分差異表達(dá)基因和單核苷酸多態(tài)性變異進(jìn)行驗(yàn)證和比較分析,為篩選與EBVaGC發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移和預(yù)后等有關(guān)的分子標(biāo)記物,闡明EBV致癌機(jī)制及尋找EBVaGC早期診斷、預(yù)后判斷和治療的新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。方法①采用高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對AGS細(xì)胞系和穩(wěn)定感染EBV的AGS-EBV細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,生物信息學(xué)技術(shù)對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,包括測序數(shù)據(jù)的預(yù)處理、基因組比對、差異表達(dá)基因分析、差異基因mRNA GO(Gene Ontology)富集分析、差異基因mRNA KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析以及EBV表達(dá)基因分析。②提取AGS細(xì)胞系和AGS-EBV細(xì)胞系以及EBV陰性胃癌細(xì)胞系(SGC7901,MKN-45,HGC-27)和EBV陽性細(xì)胞系(GT38,GT39,SNU719)總RNA,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)對轉(zhuǎn)錄組測序篩選出的部分表達(dá)差異且與腫瘤關(guān)系密切的基因(REG4、VEGF、LYPD3、ASNS、NDRG1和APEX1)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。并采用免疫組化技術(shù)檢測EBVaGC和EBVnGC組織中REG4基因的表達(dá)。③選擇山東地區(qū)胃癌組織標(biāo)本,提取新鮮胃癌組織和石蠟包埋胃癌組織DNA,PCR結(jié)合DNA測序或限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)(restrictive fragment length polymorphisms,RFLP)檢測EBVaGC和EBVnGC組織中EDAR,WDR62,GPC4,FLG,CTH,CPOX,SPG11,CASC5及ZFYVE27基因編碼區(qū)特定位點(diǎn)SNP(rs3827760,rs1008328,rs1048369,rs2065955,rs1021737,rs1131857,rs3759871,rs7177192以及rs1088299的分布。其中FLG,CPOX和CTH基因擴(kuò)增產(chǎn)物分別選擇限制性核酸內(nèi)切酶Apal I、HaeIII、ApoI酶切進(jìn)行限制性片段長度多態(tài)性分析,其余6種基因的PCR產(chǎn)物均送上海邁浦基因有限公司采用末端終止法進(jìn)行雙向測序,Chromas軟件查看測序峰圖文件,DNAStar軟件(Larsergene,version 7.0)進(jìn)行序列剪接和對比分析,并與相應(yīng)基因序列及基因文庫庫中的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行對比分析。結(jié)果①與AGS細(xì)胞系比較,穩(wěn)定感染EBV后,AGS-EBV細(xì)胞系共有3880條基因mRNA出現(xiàn)表達(dá)差異,其中1651條基因表達(dá)上調(diào),2229條基因表達(dá)下調(diào)。②差異轉(zhuǎn)錄表達(dá)mRNA GO富集分析結(jié)果表明,有較多基因參與蛋白結(jié)合、細(xì)胞質(zhì)、膜整合、細(xì)胞膜、細(xì)胞核和金屬離子結(jié)合等GO term;共有946差異基因涉及與腫瘤相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增生、細(xì)胞黏附、腫瘤抑制以及免疫相關(guān)等功能,其中上調(diào)基因360條,下調(diào)基因586條。③差異表達(dá)基因的kegg分析結(jié)果顯示,較多差異表達(dá)基因參與代謝途徑、腫瘤途徑、細(xì)胞內(nèi)吞以及灶性粘附等途徑。④ags細(xì)胞穩(wěn)定感染ebv后,細(xì)胞基因出現(xiàn)特征性的結(jié)構(gòu)改變,包括snp、as和indel等,某些改變可能與差異表達(dá)基因相關(guān)。⑤ebv穩(wěn)定感染的ags細(xì)胞中,共檢測到65種ebv基因表達(dá),以表達(dá)量計(jì)算前10位表達(dá)的ebv基因分別為bxlf2,bxlf1,lf3,bvrf1,bmrf2,bhlf1,lmp2,bilf1,bilf2以及bvlf1。⑥ebv陽性和陰性胃癌細(xì)胞系中,reg4、vegf、lypd3、asns、ndrg1和apex1基因表達(dá)差異倍數(shù)和表達(dá)趨勢與ags和ags-ebv兩種細(xì)胞系轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致。⑦免疫組化檢測結(jié)果顯示,48例ebvngc組織中有4例癌細(xì)胞中觀察到reg4陽性信號,而42例ebvagc組織均為陰性;統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明,2種胃癌組織中reg4表達(dá)無顯著性差異(p=0.12)。⑧snp分析結(jié)果顯示,分別有43例ebvngc和41例ebvagc組織edar基因擴(kuò)增和測序成功,2種胃癌組織中該基因rs3827760位點(diǎn)多態(tài)性分布無顯著性差異(χ2=0.17,p=0.94)。分別有50例ebvngc和36例ebvagc組織wdr62基因擴(kuò)增測序成功,2種胃癌組織中該基因rs1008328位點(diǎn)多態(tài)性分布無顯著性差異(χ2=0.68,p=0.79)。分別有47例ebvngc和36例ebvagc組織gpc4基因擴(kuò)增和測序成功,2種胃癌組織中該基因rs1048369位點(diǎn)多態(tài)性分布具有顯著性差異(χ2=10.17,p=0.006),基因型aa(61.11%)和等位基因a(61.11%)是ebvagc發(fā)病的危險(xiǎn)因素。分別有48例ebvngc和43例ebvagc組織flg基因pcr擴(kuò)增及酶切成功,2種胃癌組織中該基因rs2065955位點(diǎn)多態(tài)性分布具有顯著性差異(χ2=7.69,p=0.021),基因型cc(54.17%)和等位基因c(70.83%)是ebvngc發(fā)病的危險(xiǎn)因素。分別有40例ebvngc和31例ebvagc組織cth基因pcr擴(kuò)增及酶切成功,2種胃癌組織中該基因rs1021737位點(diǎn)多態(tài)性的分布無顯著性差異(χ2=1.44,p=0.60)。分別有46例ebvngc和56例ebvagc組織cpox基因擴(kuò)增及酶切成功,2種胃癌組織中該基因rs1131857位點(diǎn)多態(tài)性的分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.60,p=0.74)。分別有54例ebvngc和40例ebvagc組織spg11基因擴(kuò)增和測序成功,2種胃癌組織中該基因rs3759871位點(diǎn)多態(tài)性的分布無顯著性差異(χ2=0.55,p=0.75)。有42例ebvngc和29例ebvagc組織casc5基因擴(kuò)增并測序成功,2種胃癌組織中該基因rs7177192位點(diǎn)多態(tài)性的分布并無顯著性差異(χ2=0.99,p=0.61)。分別有56例ebvngc和37例ebvagc組織zfyve27基因擴(kuò)增并測序成功,2種胃癌組織中該基因rs10882993位點(diǎn)多態(tài)性的分布無顯著性差異(χ2=1.13,P=0.58)。結(jié)論①AGS細(xì)胞感染EBV后出現(xiàn)特異表達(dá)差異的基因,下調(diào)基因多于上調(diào)基因。在對差異基因的GO富集分析和KEGG分析顯示這些基因參與到特定的功能和信號途徑,提示EBV可通過特異的作用機(jī)制參與EBVaGC的發(fā)生發(fā)展。②EBV穩(wěn)定感染可導(dǎo)致AGS細(xì)胞某些基因結(jié)構(gòu)出現(xiàn)特征性的改變,提示EBV可通過改變宿主細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)而誘發(fā)其表達(dá)發(fā)生變化。③EBV穩(wěn)定感染的AGS細(xì)胞中可檢測到多種病毒基因的表達(dá),包括潛伏期基因和裂解期基因,推測某些病毒基因的表達(dá)是導(dǎo)致宿主細(xì)胞出現(xiàn)基因差異表達(dá)和基因結(jié)構(gòu)發(fā)生特征性改變的原因。④EBV感染后能引起宿主細(xì)胞某些腫瘤相關(guān)基因的差異表達(dá),EBV感染對宿主細(xì)胞基因表達(dá)的影響具有普遍性。⑤山東地區(qū)GPC4基因rs1048369位點(diǎn)和FLG基因rs2065955位點(diǎn)與EBVaGC密切相關(guān);GPC4基因AA基因型和等位基因A是EBVaGC致病危險(xiǎn)因素;FLG基因CC基因型和等位基因C則是EBVnGC的致病危險(xiǎn)因素。
【圖文】：

圖 2.1 差異表達(dá)基因分布概況Fig 2.1 The distribution of differentially expressed genes基因表達(dá)水平火山圖分析 繪 制 火 山 圖 可 以 了 解 差 異 表 達(dá) 基 因 的 整 體 分 布 情 況 。change)為橫坐標(biāo)，，-log10(p value)為縱坐標(biāo)，對差異表達(dá)分析中所火山圖繪制。其中橫坐標(biāo)代表基因在不同樣本中差異表達(dá)倍數(shù)變表基因表達(dá)量變化差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；紅色點(diǎn)代表顯著差異表代表非顯著性差異表達(dá)基因。本研究中，以P≤0.05，log2(fold ch，與AGS比較，AGS-EBV共有785個(gè)基因下調(diào)，250個(gè)基因上調(diào)。

圖 2.1 差異表達(dá)基因分布概況Fig 2.1 The distribution of differentially expressed genes異基因表達(dá)水平火山圖分析 繪 制 火 山 圖 可 以 了 解 差 異 表 達(dá) 基 因 的 整 體 分 布 情 況 。dchange)為橫坐標(biāo)，-log10(p value)為縱坐標(biāo)，對差異表達(dá)分析中所有火山圖繪制。其中橫坐標(biāo)代表基因在不同樣本中差異表達(dá)倍數(shù)變化表基因表達(dá)量變化差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；紅色點(diǎn)代表顯著差異表達(dá)點(diǎn)代表非顯著性差異表達(dá)基因。本研究中，以P≤0.05，log2(fold cha準(zhǔn)，與AGS比較，AGS-EBV共有785個(gè)基因下調(diào)，250個(gè)基因上調(diào)。
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.2

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