【摘要】：研究背景與目的:膽囊癌是膽道系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,早期診斷困難,惡性程度較高,易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移,預(yù)后極差。由于缺乏特異的臨床癥狀及體征,大多數(shù)病例發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已是晚期,失去手術(shù)機(jī)會(huì)。患者預(yù)后不理想的主要原因是由于術(shù)后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率較高,且腫瘤對(duì)目前常規(guī)放化療方法不敏感。因此,亟需探索治療膽囊癌的新手段。冬凌草甲素是從冬凌草等植物中提取出來的一種二萜類天然活性物質(zhì),具有抗炎、抗DNA突變、抗氧化作用。目前研究表明,冬凌草甲素對(duì)多種惡性腫瘤都有促凋亡作用。因此,本課題旨在探討冬凌草甲素在體內(nèi)及體外對(duì)膽囊癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯的作用及其機(jī)制,為膽囊癌化療探索新途徑。方法:1.冬凌草甲素誘導(dǎo)膽囊癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯通過MTT實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察冬凌草甲素對(duì)膽囊癌細(xì)胞增殖影響;利用流式細(xì)胞儀及Hoechst 33342染色分析冬凌草甲素對(duì)膽囊癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響;裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)冬凌草甲素在體內(nèi)對(duì)膽囊癌細(xì)胞的增殖及凋亡影響。2.冬凌草甲素誘導(dǎo)膽囊癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯的分子機(jī)制通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位、Caspase活性實(shí)驗(yàn)探討冬凌草甲素誘導(dǎo)膽囊癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制;采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)冬凌草甲素作用后,膽囊癌細(xì)胞凋亡及周期相關(guān)蛋白表達(dá)情況。3.冬凌草甲素通過調(diào)節(jié)HER2基因表達(dá)誘導(dǎo)膽囊癌細(xì)胞凋亡通過Real-Time PCR及Western blot實(shí)驗(yàn),檢測(cè)冬凌草甲素作用后,膽囊癌細(xì)胞中HER2基因在m RNA及蛋白水平的表達(dá)情況;構(gòu)建HER2過表達(dá)質(zhì)粒,通過流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡,Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白改變情況。收集77例膽囊癌患者及70例膽囊炎患者手術(shù)切片及臨床病理資料,通過免疫組織化學(xué)法檢測(cè)兩組HER2陽性率,與反映細(xì)胞增殖的指標(biāo)Ki-67表達(dá)的相關(guān)性分析,探討HER2過表達(dá)與膽囊癌患者臨床病理資料及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果:冬凌草甲素對(duì)膽囊癌細(xì)胞有明顯的殺傷效果,且冬凌草甲素濃度越高,孵育的時(shí)間越長(zhǎng),其殺傷作用就越顯著,呈劑量、時(shí)間依賴性。隨著冬凌草甲素作用濃度增加,膽囊癌細(xì)胞早期凋亡率明顯增加,同時(shí)其晚期凋亡率上升更為顯著,出現(xiàn)典型凋亡形態(tài)改變;同時(shí)細(xì)胞線粒體膜電位降低、線粒體完整性被破壞,細(xì)胞內(nèi)的caspase-3,-9活性上升,而caspase-8活性無明顯改變;在蛋白水平,NF-κB表達(dá)下降,胞質(zhì)中Bax/Bcl-2比例上升,誘導(dǎo)線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C向胞質(zhì)釋放,激活下游的caspase-3,誘發(fā)細(xì)胞凋亡。冬凌草甲素處理后,膽囊癌細(xì)胞中處于G0/G1期的細(xì)胞比例顯著降低,S期的細(xì)胞比例顯著升高,發(fā)生S期阻滯,cyclin A及cyclin B1表達(dá)明顯下降,而cyclin D1表達(dá)上升。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),冬凌草甲素組裸鼠成瘤體積及重量比對(duì)照組都明顯減小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素能顯著下調(diào)膽囊癌細(xì)胞HER2基因的表達(dá);過表達(dá)HER2后,能部分逆轉(zhuǎn)冬凌草甲素的抗腫瘤效應(yīng)。膽囊癌患者HER2陽性率明顯高于膽囊炎患者(46.7%vs.0%)。膽囊癌患者中HER2的表達(dá)與的病理分期有關(guān),III-IV期患者HER2陽性率明顯高于0-II期患者(59.6%vs.26.7%)。HER2蛋白表達(dá)與Ki-67表達(dá)呈正相關(guān)(Kappa系數(shù)=0.376,P=0.001)。膽囊癌患者HER2表達(dá)陽性與陰性的中位生存時(shí)間分別為18.5個(gè)月和23.5個(gè)月,1年及3年生存率分別為27.7%、16.9%和63.4%、25.1%,HER2陰性患者預(yù)后明顯優(yōu)于HER2陽性患者,且HER2的表達(dá)量及病理分期是影響患者預(yù)后的兩個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)論:冬凌草甲素通過下調(diào)HER2/neu基因的表達(dá)激活線粒體凋亡途徑,誘導(dǎo)膽囊癌細(xì)胞凋亡及發(fā)生S期阻滯。冬凌草甲素有望成為膽囊癌化療的新手段。
【圖文】：

ErbB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路突變（包括 EGFR、ErbB多因素分析顯示 ErbB 相關(guān)通路的突變提示患其下游基因的突變對(duì)膽囊癌的發(fā)生發(fā)展起著至究有望為膽囊癌的預(yù)后判斷及治療尋找到一個(gè)通過基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究和臨床病理分析，探討冬凌細(xì)胞周期阻滯的作用及其可能的分子機(jī)制。通驗(yàn)、細(xì)胞周期及凋亡實(shí)驗(yàn)、Hoechst 染色、線粒癌細(xì)胞的增殖及凋亡影響；通過 Western blo細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯可能的分子機(jī)制。通2/neu 基因在膽囊炎和膽囊癌臨床標(biāo)本中表達(dá)i-67 表達(dá)的相關(guān)性分析，探索 HER2/neu 與膽冬凌草甲素成為一種具有潛在應(yīng)用價(jià)值的新型

上海交通大學(xué)博士學(xué)位論文20μmol/L，而 NOZ 細(xì)胞的 IC50約為 10μmol/L。4）在特定的冬凌草甲素濃度培養(yǎng)條件下，孵育的時(shí)間越長(zhǎng)，冬凌草甲素對(duì)于膽囊癌細(xì)胞的殺傷作用就越顯著，，呈時(shí)間依賴性。于是，我們選取 IC50周圍 7.5，15 及 30μmol/L 三個(gè)濃度梯度完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.8

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 馮沙,周偉,趙永濱;膽囊癌28例臨床分析[J];中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志;2000年04期

2 陳云超,張青萍;應(yīng)用彩色多普勒能量圖早期診斷膽囊癌1例報(bào)道[J];同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2000年01期

3 許元鴻,田雨霖;行根治性胰十二指腸切除術(shù)治療膽囊癌1例報(bào)告[J];中國(guó)實(shí)用外科雜志;2000年11期

4 郭仁宣,許元鴻;膽囊癌的診斷和治療[J];中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2000年03期

5 查曉光,滕安寶,吳家照,方征東;34例高齡膽囊癌的診治體會(huì)[J];安徽醫(yī)學(xué);2000年05期

6 包曉莉,周曉華,張引;膽囊癌的早期診斷[J];包頭醫(yī)學(xué);2000年04期

7 趙仲民,同俊義,劉冀,肖琦;膽囊癌的超聲鑒別診斷[J];中國(guó)超聲診斷雜志;2000年01期

8 劉維燕,劉厚寶,徐子平,王炳生;膽囊癌誤診原因分析(附19例報(bào)告)[J];肝膽外科雜志;2000年05期

9 唐群科,張瑛;膽囊癌9例診治分析[J];肝膽外科雜志;2000年06期

10 張曉紅,程錚,申霄;膽囊癌39例臨床分析[J];河北醫(yī)藥;2000年07期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 何婉媛;袁錦芳;毛楓;王文平;;膽囊癌的超聲漏誤診分析[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第六次全國(guó)超聲醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2001年

2 張海鋒;;淺談雙螺旋CT在膽囊癌診斷中的價(jià)值[A];全國(guó)醫(yī)學(xué)影像技術(shù)學(xué)術(shù)會(huì)議（CMIT-2004）論文匯編[C];2004年

3 王小紅;馬勝林;鐘海均;;膽囊癌的綜合治療進(jìn)展[A];2007醫(yī)學(xué)前沿論壇暨第十屆全國(guó)腫瘤藥理與化療學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2007年

4 李景澤;孫媛媛;于鳳海;胡和平;;膽囊癌100例臨床及組化分析[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)消化病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編（下冊(cè)）[C];2007年

5 湯煥亮;曹浩強(qiáng);費(fèi)建國(guó);;膽囊癌的超聲漏誤診分析[A];2007年浙江省超聲醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2007年

6 陶云年;張文奇;王善軍;王和平;夏龍飛;;螺旋CT在膽囊癌診斷中的價(jià)值[A];2013年浙江省放射學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2013年

7 崔云甫;;膽囊癌外科治療方法的選擇[A];中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)膽道腫瘤專業(yè)委員會(huì)成立大會(huì)暨第一屆全國(guó)膽道腫瘤學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2009年

8 李升平;王俊;梁哲昭;;膽囊癌中吲哚胺2,3-雙加氧酶的表達(dá)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的浸潤(rùn)及其臨床意義[A];中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)膽道腫瘤專業(yè)委員會(huì)成立大會(huì)暨第一屆全國(guó)膽道腫瘤學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2009年

9 陸秀偉;謝筱f^;徐莉萍;鄧海旋;張?jiān)３?;膽囊癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的多層螺旋CT分析[A];第十一次全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合影像學(xué)術(shù)研討會(huì)暨全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合影像學(xué)研究進(jìn)展學(xué)習(xí)班資料匯編[C];2010年

10 霍苓;陳敏華;廖盛日;嚴(yán)昆;黃信孚;;體表超聲對(duì)膽囊癌分期診斷研究[A];2000全國(guó)腫瘤學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2000年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 天津市腫瘤醫(yī)院肝膽腫瘤科主任 宋天強(qiáng);膽囊癌 誰高危怎么切都有新觀點(diǎn)[N];健康報(bào);2013年

2 記者 胡德榮;膽囊癌關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)基因被捕獲[N];健康報(bào);2014年

3 記者 唐聞佳;膽囊癌防治有望獲新途徑[N];文匯報(bào);2014年

4 記者 白毅;膽囊癌關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)基因首次揭示[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2014年

5 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院教授 羅學(xué)宏;膽囊癌的危險(xiǎn)因素知多少[N];大眾衛(wèi)生報(bào);2005年

6 吳葉青 蔣廷玉;膽囊癌患者激增需引起關(guān)注[N];新華日?qǐng)?bào);2005年

7 北京友誼醫(yī)院 王潤(rùn)華;膽囊癌易誤診[N];衛(wèi)生與生活報(bào);2007年

8 王麗;膽囊癌發(fā)生機(jī)理研究獲突破[N];科技日?qǐng)?bào);2007年

9 王潤(rùn)華;膽囊癌易誤診[N];家庭醫(yī)生報(bào);2008年

10 本報(bào)記者 沙文茹;及早出擊 預(yù)防膽囊癌[N];中國(guó)消費(fèi)者報(bào);2003年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 付亮;幾丁質(zhì)酶3樣蛋白1在膽囊癌中的作用機(jī)制[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

2 杜強(qiáng);TNF-α對(duì)膽囊癌VEGF-C表達(dá)及淋巴管生成的影響及其機(jī)制[D];福建醫(yī)科大學(xué);2014年

3 朱廣偉;RIP-1促進(jìn)膽囊癌增殖侵襲轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

4 張彥;膽囊癌臨床病理特征、系統(tǒng)炎癥及免疫微環(huán)境對(duì)預(yù)后的預(yù)測(cè)研究[D];山東大學(xué);2015年

5 沈吉良;雙特異性磷酸酶1(Dusp1)在膽囊癌生長(zhǎng)、侵襲轉(zhuǎn)移及血管形成中的作用[D];浙江大學(xué);2016年

6 包潤(rùn)發(fā);冬凌草甲素對(duì)膽囊癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯的作用及其分子機(jī)制[D];上海交通大學(xué);2015年

7 束翌俊;Hsa-miR-29c調(diào)控人膽囊癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究[D];上海交通大學(xué);2015年

8 蔣明明;肝細(xì)胞癌和膽囊癌基因表達(dá)譜分析及肝癌相關(guān)基因單核苷酸多態(tài)性研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2016年

9 黃海林;膽囊癌組織相關(guān)蛋白的篩選與鑒定[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2009年

10 宗華杰;人重組TRAIL治療膽囊癌的實(shí)驗(yàn)研究[D];復(fù)旦大學(xué);2009年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 周一鳴;102例膽囊癌臨床與預(yù)后分析[D];浙江大學(xué);2007年

2 劉學(xué)青;80例膽囊癌診療分析[D];河北醫(yī)科大學(xué);2012年

3 洪志鵬;雙光子激發(fā)熒光顯微成像技術(shù)在膽囊癌診斷中的應(yīng)用[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

4 魯超;膽囊癌臨床病理學(xué)特征與預(yù)后的相關(guān)性研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

5 夏曉博;p53和β-catenin在膽囊癌組織中的表達(dá)及意義[D];鄭州大學(xué);2015年

6 段安琪;胰頭后淋巴結(jié)清掃在T3、T4期膽囊癌治療中的意義[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2015年

7 解雷;膽囊癌微環(huán)境中MDSCs及其亞群細(xì)胞檢測(cè)和干預(yù)治療研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2015年

8 許丁偉;EIF-5A2蛋白在膽囊癌組織中的表達(dá)和臨床分析[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2015年

9 封彥青;Shh和Foxm1在膽囊癌中的表達(dá)和臨床意義及其與腫瘤的關(guān)系[D];南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院;2015年

10 楊登;膽囊癌臨床分期及手術(shù)方式與預(yù)后的關(guān)系[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2015年

本文編號(hào)：2533567