【摘要】：研究目的對(duì)小鼠胃粘成纖維細(xì)胞(Mouse gastric mucosa fibroblast,MGMF)進(jìn)行原代分離培養(yǎng),并構(gòu)建其體外活化模型,以模擬體內(nèi)胃癌相關(guān)成纖維細(xì)胞的活化,在此基礎(chǔ)之上探索長(zhǎng)鏈非編碼RNA-H19基因(Long non-coding RNA-H19,lncRNA-H19)與胃癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(Gastric cancer-associated fibroblast,GCAF)活化的相關(guān)性。研究方法用組織塊法對(duì)小鼠(C57BL/6小鼠)的胃粘膜成纖維細(xì)胞進(jìn)行原代分離培養(yǎng)。成功培養(yǎng)后,在光學(xué)顯微鏡下對(duì)其形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行鑒定,同時(shí)輔以免疫熒光染色鑒定細(xì)胞內(nèi)波形絲蛋白(Vimentin)、結(jié)蛋白(Desmin)的表達(dá)的表達(dá)情況,以進(jìn)一步確認(rèn)其細(xì)胞來(lái)源并分析純度;在成功對(duì)小鼠胃粘成纖維細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)后,利用與小鼠胃癌細(xì)胞(MFC)共培養(yǎng)加上間隙性缺氧處理的方法構(gòu)建GCAF的體外活化模型,以模擬胃癌微環(huán)境中GCAF的活化過(guò)程。建模后,利用ELISA法對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中重要的活化效應(yīng)分子進(jìn)行檢測(cè),利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time Quantitative PCR,qPCR)分別對(duì)活化相關(guān)蛋白mRNA進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)利用CCK-8法、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞技術(shù)分別對(duì)GCAF體外活化模型進(jìn)行細(xì)胞增殖、遷移及凋亡實(shí)驗(yàn),并用CCK-8法檢測(cè)MGMF、GCAF分別與MFC共培養(yǎng)后MFC的增殖活力變化,以驗(yàn)證GCAF體外活化模型構(gòu)建是否成功;在成功建模的基礎(chǔ)上,利用qPCR方法對(duì)比分析MGMF及GCAF中l(wèi)ncRNA-H19基因的表達(dá)情況,以驗(yàn)證lncRNA-H19與GCAF的活化有相關(guān)性。同時(shí),我們進(jìn)一步利用siRNA干擾基因表達(dá)的方法,對(duì)GCAF中的lncRNA-H19基因進(jìn)行干擾沉默,隨后用ELISA法檢測(cè)干擾后相關(guān)活化因子的表達(dá)情況,利用CCK-8法、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞技術(shù)分別對(duì)干擾表達(dá)后的GCAF進(jìn)行細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡實(shí)驗(yàn),以進(jìn)一步證實(shí)lncRNA-H19與GCAF的活化有明確相關(guān)性。均值的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或方差分析。研究結(jié)果光學(xué)顯微鏡下見(jiàn)所分離的細(xì)胞呈梭狀或兩頭尖的長(zhǎng)條狀,大小較均一,呈貼壁放射狀生長(zhǎng),符合成纖維細(xì)胞的形態(tài)特征。免疫熒光染色技術(shù)鑒定結(jié)果顯示波形絲蛋白(Vimentin)表達(dá)陽(yáng)性,而結(jié)蛋白(Desmin)表達(dá)陰性,符合成纖維細(xì)胞的蛋白表達(dá)特征;活化模型建立后,GCAF培養(yǎng)液中重要活化效應(yīng)分子IL-6、TGF-β1、HGF及CXCL12表達(dá)量均較MGMF明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。同時(shí),GCAF細(xì)胞內(nèi)的α-SMA、FAP相關(guān)mRNA的相對(duì)表達(dá)量也均明顯高于MGMF(P0.05)。另外,細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)顯示,GCAF的增殖活性及遷移能力較MGMF明顯增強(qiáng),而細(xì)胞凋亡明顯降低,且GCAF能明顯促進(jìn)MFC的增殖,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);qPCR法對(duì)細(xì)胞內(nèi)的lncRNA-H19表達(dá)情況檢測(cè)顯示,GCAF的表達(dá)量較MGMF顯著上調(diào)(2.10±0.14 VS.1.00±0.09,P0.001)。而lncRNA-H19干擾表達(dá)后,GCAF培養(yǎng)液中前述重要活化效應(yīng)分子的表達(dá)量顯著下降(P0.05),同時(shí)細(xì)胞的增殖活性及侵襲能力也顯著降低,而細(xì)胞凋亡率則顯著升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。研究結(jié)論LncRNA-H19與GCAF的活化具有明顯的相關(guān)性,抑制LncRNA-H19的表達(dá)可以抑制GCAF的增殖與侵襲,并促進(jìn)其凋亡,這提示LncRNA-H19有可能成為胃癌的臨床治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。因此進(jìn)一步對(duì)LncRNA-H19參與GCAF活化的具體機(jī)制研究十分必要。
【圖文】：

第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文（11）熒光顯微鏡觀察并拍照記錄。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、形態(tài)學(xué)特征是目前成纖維細(xì)胞鑒定的主要方法，本實(shí)驗(yàn)在顯微鏡下對(duì)所分離的小鼠胃粘膜成纖維細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察顯示，當(dāng)細(xì)胞首次長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)基時(shí)，可見(jiàn)細(xì)胞以長(zhǎng)條形或梭型為主，但其中也參雜有一些雜細(xì)胞，如圖 1.1 所示；當(dāng)進(jìn)行純化并傳代后，細(xì)胞呈梭狀或兩頭尖的長(zhǎng)條狀，軸突較長(zhǎng)，，大小較均一，呈貼壁放射狀生長(zhǎng)，符合成纖維細(xì)胞形態(tài)。而雜細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞純度理想，如圖 1.2 所示。

以長(zhǎng)條形或梭型為主，但其中也參雜有一些雜細(xì)胞，如圖 1.1 所示；當(dāng)進(jìn)行純化并傳代后，細(xì)胞呈梭狀或兩頭尖的長(zhǎng)條狀，軸突較長(zhǎng)，大小較均一，呈貼壁放射狀生長(zhǎng)，符合成纖維細(xì)胞形態(tài)。而雜細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞純度理想，如圖 1.2 所示。 100 倍 200 倍圖 1.1 普通光學(xué)顯微鏡下未進(jìn)行純化傳代的小鼠胃粘膜成纖維細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R735.2

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本文編號(hào)：2533309