發(fā)布時間：2019-09-08 15:06

【摘要】：研究目的對小鼠胃粘成纖維細胞(Mouse gastric mucosa fibroblast,MGMF)進行原代分離培養(yǎng),并構(gòu)建其體外活化模型,以模擬體內(nèi)胃癌相關(guān)成纖維細胞的活化,在此基礎(chǔ)之上探索長鏈非編碼RNA-H19基因(Long non-coding RNA-H19,lncRNA-H19)與胃癌相關(guān)成纖維細胞(Gastric cancer-associated fibroblast,GCAF)活化的相關(guān)性。研究方法用組織塊法對小鼠(C57BL/6小鼠)的胃粘膜成纖維細胞進行原代分離培養(yǎng)。成功培養(yǎng)后,在光學(xué)顯微鏡下對其形態(tài)學(xué)特征進行鑒定,同時輔以免疫熒光染色鑒定細胞內(nèi)波形絲蛋白(Vimentin)、結(jié)蛋白(Desmin)的表達的表達情況,以進一步確認其細胞來源并分析純度;在成功對小鼠胃粘成纖維細胞進行分離培養(yǎng)后,利用與小鼠胃癌細胞(MFC)共培養(yǎng)加上間隙性缺氧處理的方法構(gòu)建GCAF的體外活化模型,以模擬胃癌微環(huán)境中GCAF的活化過程。建模后,利用ELISA法對細胞培養(yǎng)液中重要的活化效應(yīng)分子進行檢測,利用實時熒光定量PCR(Real-time Quantitative PCR,qPCR)分別對活化相關(guān)蛋白mRNA進行檢測,同時利用CCK-8法、Transwell遷移實驗及流式細胞技術(shù)分別對GCAF體外活化模型進行細胞增殖、遷移及凋亡實驗,并用CCK-8法檢測MGMF、GCAF分別與MFC共培養(yǎng)后MFC的增殖活力變化,以驗證GCAF體外活化模型構(gòu)建是否成功;在成功建模的基礎(chǔ)上,利用qPCR方法對比分析MGMF及GCAF中l(wèi)ncRNA-H19基因的表達情況,以驗證lncRNA-H19與GCAF的活化有相關(guān)性。同時,我們進一步利用siRNA干擾基因表達的方法,對GCAF中的lncRNA-H19基因進行干擾沉默,隨后用ELISA法檢測干擾后相關(guān)活化因子的表達情況,利用CCK-8法、Transwell侵襲實驗及流式細胞技術(shù)分別對干擾表達后的GCAF進行細胞增殖、侵襲及凋亡實驗,以進一步證實lncRNA-H19與GCAF的活化有明確相關(guān)性。均值的比較采用獨立樣本t檢驗或方差分析。研究結(jié)果光學(xué)顯微鏡下見所分離的細胞呈梭狀或兩頭尖的長條狀,大小較均一,呈貼壁放射狀生長,符合成纖維細胞的形態(tài)特征。免疫熒光染色技術(shù)鑒定結(jié)果顯示波形絲蛋白(Vimentin)表達陽性,而結(jié)蛋白(Desmin)表達陰性,符合成纖維細胞的蛋白表達特征;活化模型建立后,GCAF培養(yǎng)液中重要活化效應(yīng)分子IL-6、TGF-β1、HGF及CXCL12表達量均較MGMF明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。同時,GCAF細胞內(nèi)的α-SMA、FAP相關(guān)mRNA的相對表達量也均明顯高于MGMF(P0.05)。另外,細胞功能實驗顯示,GCAF的增殖活性及遷移能力較MGMF明顯增強,而細胞凋亡明顯降低,且GCAF能明顯促進MFC的增殖,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);qPCR法對細胞內(nèi)的lncRNA-H19表達情況檢測顯示,GCAF的表達量較MGMF顯著上調(diào)(2.10±0.14 VS.1.00±0.09,P0.001)。而lncRNA-H19干擾表達后,GCAF培養(yǎng)液中前述重要活化效應(yīng)分子的表達量顯著下降(P0.05),同時細胞的增殖活性及侵襲能力也顯著降低,而細胞凋亡率則顯著升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。研究結(jié)論LncRNA-H19與GCAF的活化具有明顯的相關(guān)性,抑制LncRNA-H19的表達可以抑制GCAF的增殖與侵襲,并促進其凋亡,這提示LncRNA-H19有可能成為胃癌的臨床治療的一個新靶點。因此進一步對LncRNA-H19參與GCAF活化的具體機制研究十分必要。
【圖文】：

第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文（11）熒光顯微鏡觀察并拍照記錄。三、實驗結(jié)果1、形態(tài)學(xué)特征是目前成纖維細胞鑒定的主要方法，本實驗在顯微鏡下對所分離的小鼠胃粘膜成纖維細胞進行形態(tài)學(xué)觀察顯示，當(dāng)細胞首次長滿培養(yǎng)基時，可見細胞以長條形或梭型為主，但其中也參雜有一些雜細胞，如圖 1.1 所示；當(dāng)進行純化并傳代后，細胞呈梭狀或兩頭尖的長條狀，軸突較長，，大小較均一，呈貼壁放射狀生長，符合成纖維細胞形態(tài)。而雜細胞明顯減少，細胞純度理想，如圖 1.2 所示。

以長條形或梭型為主，但其中也參雜有一些雜細胞，如圖 1.1 所示；當(dāng)進行純化并傳代后，細胞呈梭狀或兩頭尖的長條狀，軸突較長，大小較均一，呈貼壁放射狀生長，符合成纖維細胞形態(tài)。而雜細胞明顯減少，細胞純度理想，如圖 1.2 所示。 100 倍 200 倍圖 1.1 普通光學(xué)顯微鏡下未進行純化傳代的小鼠胃粘膜成纖維細胞的形態(tài)特點
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.2

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本文編號：2533309