發(fā)布時間：2019-09-03 20:09

【摘要】：背景與目的胰腺癌是一種高度惡性,發(fā)展極為迅速的癌癥,其預(yù)后差、死亡率高,特別是胰腺導(dǎo)管腺癌,五年生存率低于5%。胰腺癌在臨床上往往依靠影像學(xué)檢測,其所用診斷試劑盒特異性、準(zhǔn)確性低,使其早期發(fā)現(xiàn)率低,鑒別診斷也非常困難。特別是近年來,胰腺癌發(fā)病率逐年上升。胰腺癌早期癥狀不明顯,臨床上尚無經(jīng)濟(jì)有效的早期發(fā)現(xiàn)方法。分子診斷學(xué)是近年發(fā)展迅速的新興學(xué)科,目前已成為常用的臨床診斷方法之一。小分子RNA(micro RNAs,miRNAs)能夠在胰腺癌中特異性表達(dá)的特點(diǎn)使其可以作為胰腺癌的新型診斷標(biāo)志物,相關(guān)的檢測技術(shù)也隨之不斷發(fā)展。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),mi RNA的抑制和上調(diào)對胰腺癌細(xì)胞的存活、增殖、侵襲、凋亡和轉(zhuǎn)移有顯著影響,其有望成為胰腺癌預(yù)測/預(yù)后的生物標(biāo)記或診斷靶標(biāo)。miRNA在真核生物中被發(fā)現(xiàn),長約20~25個核苷酸,是內(nèi)源性、具有調(diào)控功能的非編碼RNA。成熟的miRNAs是由較長的初級轉(zhuǎn)錄物(長達(dá)1000個核苷酸)經(jīng)過雙鏈RNA特異性核糖核酸酶Drosha、Dicer的加工剪切而產(chǎn)生,隨后被組裝進(jìn)RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex,RISC),通過堿基互補(bǔ)配對的方式識別目標(biāo)mRNA,可按照不同的互補(bǔ)程度指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解目標(biāo)mRNA或者阻遏目標(biāo)mRNA的翻譯。有相關(guān)研究表明,mi R-663可通過靶向TGF-β1抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,miR-663胰腺癌組織中miR-663的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織中miR-663的表達(dá)水平;利用生物信息學(xué)軟件targetscan和diana-microt預(yù)測,結(jié)果顯示真核細(xì)胞延長因子1-a2(eukaryoticelongationfactor1-a2,eef1a2)與mir-663在胰腺癌中具有相關(guān)性,eef1a2可能為mir-663作用靶標(biāo)。本研究的目的在于了解mir-663在胰腺癌及癌旁組織中的表達(dá)情況,分析其與胰腺癌患者病理特征及生存期的相關(guān)性、過表達(dá)mir-663對胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡等特性的影響,初步驗(yàn)證mir-663作用靶標(biāo)和調(diào)控機(jī)制。方法1.于2007年至2009年在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院和河南省腫瘤醫(yī)院收集了68例經(jīng)歷胰十二指腸切除術(shù)或胰腺導(dǎo)管末端切除術(shù)胰腺癌患者的癌組織和癌旁組織,置于液氮中保存。標(biāo)本中eef1a2蛋白表達(dá)水平采用westernblot實(shí)驗(yàn)檢測;mir-663和eef1a2mrna的表達(dá)水平采用熒光定量pcr(quantitativereal-timepcr,qrt-pcr)方法檢測,并分析其與胰腺癌不同進(jìn)展期和患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的相關(guān)性。對上述所有胰腺癌患者隨訪,進(jìn)行kaplan-meier生存分析,以判斷胰腺癌的臨床病理特征和患者生存期之間的相關(guān)性以及eef1a2和mir-663表達(dá)水平和患者生存期之間的關(guān)系。對正常胰腺細(xì)胞hpde6-c7及胰腺癌細(xì)胞panc-1,capan-2,sw1990,bxpc3和aspc-1進(jìn)行qrt-pcr檢測,以觀察mir-663的表達(dá)水平。對正常胰腺細(xì)胞hpde6-c7及胰腺癌細(xì)胞panc-1,capan-2,sw1990,bxpc3和aspc-1進(jìn)行westernblot實(shí)驗(yàn),以觀察eef1a2蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)水平。2.將胰腺癌細(xì)胞panc-1和aspc-1分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染。根據(jù)不同處理分為以下三組:a組為mir-663組,轉(zhuǎn)染mir-663agomir和脂質(zhì)體復(fù)合物;b組為nc組(陰性對照組),轉(zhuǎn)染mir-663agomirnegativecontrol和脂質(zhì)體復(fù)合物;c組為空白對照組(僅加入脂質(zhì)體復(fù)合物)。細(xì)胞放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37℃、5%co2)中培養(yǎng)備用。轉(zhuǎn)染24h后對細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果進(jìn)行qrt-pcr檢測。3.對a、b、c三組胰腺癌細(xì)胞進(jìn)行cck-8實(shí)驗(yàn)及克隆形成實(shí)驗(yàn)以觀察mir-663對胰腺癌細(xì)胞增殖的影響。4.移植瘤實(shí)驗(yàn)。分別將空白對照組和mir-663組panc-1胰腺癌細(xì)胞皮下注射入六周齡雄性balb/c裸鼠體內(nèi),并按照公式測量計算成瘤大小,對比差異。5.將陰性對照組和mir-663組胰腺癌細(xì)胞(panc-1和aspc-1)進(jìn)行transwell實(shí)驗(yàn)以觀察mir-663對細(xì)胞侵襲能力的影響。6.將陰性對照組和mir-663組胰腺癌細(xì)胞(panc-1和aspc-1)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測和hochest染色,以觀察mir-663對胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響。7.利用targetscan和diana-microt軟件,以生物信息學(xué)方法分析并預(yù)測mir-663的作用靶點(diǎn)。構(gòu)建野生及突變型eef1a2的3’utr區(qū)重組報告基因載體,將其與mir-663激動劑或mir-663agomirnegativecontrol共轉(zhuǎn)染至胰腺癌細(xì)胞panc-1和aspc-1中,利用westernblot實(shí)驗(yàn)和雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證mir-663的作用靶點(diǎn)。8.回復(fù)實(shí)驗(yàn)。構(gòu)建無3’utr區(qū)eef1a2的表達(dá)載體,僅轉(zhuǎn)染或與mir-663agomir共轉(zhuǎn)染入胰腺癌細(xì)胞panc-1和aspc-1中,通過回復(fù)實(shí)驗(yàn)的方法分析mir-663調(diào)控eef1a2表達(dá)的作用機(jī)制。9.下調(diào)eef1a2與上調(diào)mir-663對胰腺癌細(xì)胞作用效果比較。將eef1a2-sirnas和mir-663agomir轉(zhuǎn)入胰腺癌細(xì)胞panc-1,比較二者對胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的作用效果。利用westernblot檢測相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果1.胰腺癌組織mir-663的表達(dá)水平明顯低于癌旁組織(p0.05),eef1a2mrna和蛋白表達(dá)水平明顯高于癌旁組織(p0.05),并且mir-663與eef1a2的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。eef1a2和mir-663的表達(dá)水平與胰腺癌tnm分期及患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)顯著相關(guān)(p0.05)。kaplan-meier生存分析結(jié)果表明,胰腺癌患者的生存期與腫瘤直徑(p0.001)、分化程度(p0.001)、臨床分期(p0.001)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(p0.001)顯著相關(guān),而和其性別(p=0.975)、年齡(p=0.523)和腫瘤位置(p=0.613)并無顯著相關(guān)性。高表達(dá)eef1a2的胰腺癌患者其生存期更短,而高表達(dá)mir-663的胰腺癌患者其生存期更長(p0.05),eef1a2和mir-663與胰腺癌患者的生存期相關(guān)。對不同細(xì)胞系hpde6-c7,panc-1,capan-2,sw1990,bxpc3和aspc-1進(jìn)行熒光定量pcr檢測,結(jié)果顯示,與正常胰腺細(xì)胞系hpde6-c7相比較,mir-663在胰腺癌細(xì)胞(panc-1,capan-2,sw1990,bxpc3andaspc-1)中被下調(diào)�？捎^察到其表達(dá)水平存在統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,胰腺癌細(xì)胞中eef1a2蛋白表達(dá)水平顯著高于正常胰腺細(xì)胞中eef1a2蛋白表達(dá)水平(p0.05)。2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染后檢測結(jié)果顯示,mir-663在mir-663組中的表達(dá)水平明顯高于blank組及nc組(p0.05),表明胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染mir-663上調(diào)了mir-663的表達(dá)水平。3.cck-8實(shí)驗(yàn)顯示,與空白對照組和陰性對照組相比較,mir-663組的panc-1細(xì)胞及aspc-1細(xì)胞,在第1、2、3天時在450nm處的吸光度值均下降,表明轉(zhuǎn)染mir-663后,兩種胰腺癌細(xì)胞的增殖水平均有顯著降低。差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)�？寺⌒纬蓪�(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,mir-663組的克隆數(shù)明顯少于空白對照組和陰性對照組。差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。4.移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過表達(dá)mir-663agomir的panc-1細(xì)胞注射入裸鼠體內(nèi)后可抑制腫瘤生長。差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。5.transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,mir-663組穿過基底膜的胰腺癌細(xì)胞數(shù)與nc組相比明顯減少。數(shù)值差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。6.流式細(xì)胞術(shù)、hochest染色實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示,與nc組相比,mir-663組胰腺癌細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測的凋亡數(shù)及熒光顯微鏡下的凋亡細(xì)胞數(shù)均顯著增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。7.westernblot和雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,eef1a2是mir-663的作用靶標(biāo)。8.回復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,mir-663作用于eef1a2的3'utr區(qū),負(fù)向調(diào)控其表達(dá),參與胰腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡。9.比較下調(diào)eef1a2與上調(diào)mir-663對胰腺癌細(xì)胞的作用效果及相關(guān)基因表達(dá)檢測結(jié)果表明,下調(diào)eef1a2的作用與上調(diào)mir-663的作用類似,說明mir-663對于胰腺癌的抑制效應(yīng)至少有一部分是由于作用于eef1a2而引起的。結(jié)論1.胰腺癌組織中miR-663表達(dá)水平異常降低,其表達(dá)水平與胰腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及TNM分期有關(guān)。2.miR-663上調(diào)可有效抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲,促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的凋亡。3.miR-663作用于eEF1A2的3'UTR區(qū)負(fù)向調(diào)控其表達(dá)水平,從而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.9

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3 孫月;eEF1A2在前列腺癌中的高表達(dá)促進(jìn)前列腺癌的增殖以及抑制凋亡[D];浙江大學(xué);2015年

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本文編號：2531554