【摘要】：目的:檢測BubR1在人肝癌細胞中的表達,觀察沉默BubR1后對人HBV(Hepatitis B virus)相關(guān)肝癌細胞增殖、凋亡和周期的影響,驗證BubR1和HBx(HBV X protein)蛋白的相互關(guān)系以及BubR1影響肝癌細胞活性可能的機制。方法:1.運用RT-PCR及Western Blot技術(shù)檢測人HBV陽性肝癌細胞株(HepG2.2.15)及HBV陰性肝癌細胞株(HepG2、SMMC7721和Huh7)中BubR1的表達,并篩選出Bub R1高表達細胞株。2.設(shè)計并合成3對針對BubR1的特異性小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA),通過陽離子脂質(zhì)體法進行瞬時轉(zhuǎn)染。體外培養(yǎng)肝癌細胞,實驗共設(shè)Nomal組、Control-siRNA組及BubR1-1、BubR1-2、BubR1-3各轉(zhuǎn)染組3.運用RT-PCR及Western Blot技術(shù)檢測各實驗組中BubR1在mRNA和蛋白水平的變化,篩選出沉默效果最好的BubR1-siRNA序列。4.通過MTT比色法檢測沉默BubR1后細胞增殖能力的改變,運用Annexin V-FITC/PI染色流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡和周期的改變。5.通過Western Blot技術(shù)檢測沉默BubR1后各實驗組細胞MAPKs各信號通路(ERK1/2、JNK、p38MAPK)節(jié)點分子、NF-κB信號通路及凋亡相關(guān)蛋白(Bax、Caspase-3)表達量改變,以明確BubR1影響肝癌細胞活性可能的機制。6.通過免疫共沉淀及雙色免疫熒光結(jié)合激光共聚焦技術(shù)分別檢測HBx蛋白與BubR1蛋白在HBV陽性肝癌細胞中的相互作用關(guān)系及在細胞中的定位。結(jié)果:1.RT-PCR及Western Blot結(jié)果均顯示,在四種肝癌細胞系中,BubR1基因均呈陽性表達,且在HepG2.2.15細胞中BubR1 mRNA和蛋白水平皆呈相對最高表達。2.分別用3對特異性BubR1-siRNAs轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細胞,24h和48h后分別提取mRNA和蛋白,發(fā)現(xiàn)3個轉(zhuǎn)染組(BubR1-1、BubR1-2、BubR1-3組)的mRNA和蛋白表達水平相比較Nomal組、Control-siRNA組下降,且BubR1-3組抑制效果最明顯。3.MTT比色法檢測細胞增殖及平板克隆實驗發(fā)現(xiàn),BubR-3轉(zhuǎn)染組HepG2.2.15細胞增殖能力較Nomal組、Control-siRNA組明顯受到抑制。4.流式細胞術(shù)檢測顯示,BubR1-3轉(zhuǎn)染組細胞的凋亡率增高,G1期細胞顯著減少,S期細胞明顯增加,即細胞阻滯于S期。5.Western Blot檢測顯示,沉默BubR1可顯著抑制p-ERK蛋白和p-NF-κB蛋白的表達,而p-P38、p-JNK1/2以及各通路非磷酸化蛋白的表達較Nomal組、Control-siRNA組相比無明顯變化。6.Western Blot檢測顯示,沉默BubR1,BubR1-3組中Bax蛋白和Caspase-3蛋白表達水平較Nomal組、Control-siRNA組增高。6.免疫共沉淀技術(shù)顯示,瓊脂糖珠、BubR1及HBx能夠共同形成瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物,HBx與BubR1能直接或間接地結(jié)合。雙色免疫熒光激光共聚焦檢測顯示,BubR1及HBx在HepG2.2.15細胞質(zhì)和細胞核中均有分布,且BubR1與HBx在HepG2.2.15細胞核內(nèi)共定位。結(jié)論:1.抑制BubR1基因的表達可使HBV陽性肝癌細胞株HepG2.2.15增殖能力降低,細胞凋亡增加,細胞阻滯于S期。2.BubR1基因沉默后可能通過影響NF-κB、ERK1/2信號通路途徑抑制HBV陽性肝癌細胞的增殖能力,且BubR1可能與HBx相互作用,發(fā)揮協(xié)同促癌的作用。
【圖文】：

綜述BubR1蛋白是SAC的重要組成成分，，是一個對著絲粒起反應(yīng)的多結(jié)構(gòu)域蛋白激酶。哺乳動物BubR1基因定位于染色體15q14-21，是酵母菌Mad3的同源基因，其編碼的BubR1蛋白相對分子質(zhì)量約125 000，由1050個氨基酸殘基組成。Yoon等[4]則證實BubR1是由1個KEN盒模體，1個Mad3樣域，1個Bub3連接域和1個激酶域組成。BubR1蛋白擁有與酵母菌Mad3蛋白同源性的N末端：招募Blinkin/KNL1連接到著絲粒上的TPR(重復(fù)三角四肽)功能域，KNL1是KMN網(wǎng)的核心成分，對染色體著絲點-微管排列相互作用至關(guān)重要；用于連接Bub3的GLEBS模體(Gle-2-binding sequence)；以及用于連接Cdc20和APC/C的存在于哺乳動物的KEN盒模體和D盒模[5]。而不同于酵母Mad3的是，哺乳動物BubR1類似于BuB1的激酶結(jié)構(gòu)域則在C端[2]。多年來，人們致力于揭示BubR1激酶作用的底物，然而至今尚未能確認BubR1的激酶活性。有人認為BubR1的C末端激酶域是Bub1擴增導(dǎo)致的偽激酶結(jié)構(gòu)域，因此認為BubR1并沒有激酶活性[6]。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 蔣小玲,鄧欣,聶廣,楊大國;剔毒護肝方及其拆方對人肝癌細胞增殖及端粒酶活性的影響[J];中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志;2004年02期

2 孫宏偉;沈鋒;吳孟超;;瞬時受體勢C可能存在介導(dǎo)肝癌細胞增殖的作用[J];腫瘤;2006年04期

3 田文禮;趙亞周;彭文君;;蜂膠對肝癌細胞增殖及其脂肪沉積的影響[J];食品科學(xué);2012年09期

4 楊春;陳文;鐘曉琳;王忠瓊;陳楓;夏紀毅;;丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4B對肝癌細胞增殖的影響[J];山東醫(yī)藥;2012年32期

5 王靜;宗瑞強;莫艷波;田國華;郝禮森;張國志;;無花果漿液對肝癌細胞增殖抑制作用研究[J];中國煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志;2014年04期

6 康九紅,魏亞明,鄭榮梁;二乙基二硫代氨基甲酸鈉對人肝癌細胞增殖、再分化與凋亡的作用(英文)[J];Acta Pharmacologica Sinica;2001年09期

7 胡輝,荊緒斌,蔡先彬;過氧化氫在乙醇抑制肝癌細胞增殖中的作用[J];臨床消化病雜志;2005年03期

8 史冬梅;馬天樂;涂水平;譚繼宏;喬敏敏;章永平;江石湖;;X-染色體相關(guān)凋亡抑制蛋白相關(guān)因子1抑制肝癌細胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的實驗研究[J];中華消化雜志;2006年10期

9 趙新;;兒茶素抑制肝癌細胞增殖、誘導(dǎo)凋亡作用研究[J];中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志;2012年10期

10 王迎春;劉炎芳;邢蘭花;楊旭;李小歡;;曲古抑菌素A對人肝癌細胞增殖凋亡影響及其機制的探討[J];中華腫瘤防治雜志;2013年06期

相關(guān)會議論文 前10條

1 徐艷敏;錢程;;低濃度阿霉素促進肝癌細胞增殖[A];中華醫(yī)學(xué)會病理學(xué)分會2010年學(xué)術(shù)年會日程及論文匯編[C];2010年

2 田晶;周士勝;陶凌;董玲;楊安鋼;;尼氟滅酸對肝癌細胞增殖的影響[A];中國生理學(xué)會第21屆全國代表大會暨學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2002年

3 秦敏;白文元;譚莉莉;;白藜蘆醇抑制人肝癌細胞增殖與促進其凋亡的作用[A];中華醫(yī)學(xué)會第七次全國消化病學(xué)術(shù)會議論文匯編（下冊）[C];2007年

4 鐘寧;董明;程寶泉;張尚忠;李延青;;大蒜素和阿霉素對裸小鼠皮下移植肝癌細胞增殖、分化和凋亡影響的實驗研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第七次全國消化病學(xué)術(shù)會議論文匯編（下冊）[C];2007年

5 陶立平;陶佳南;陶富山;;寬帶中遠紅外線輻射對肝癌細胞增殖細胞核抗原的研究[A];第八屆全國紅外加熱暨紅外醫(yī)學(xué)發(fā)展研討會論文及論文摘要集[C];2001年

6 劉珊林;;抗氧化干預(yù)對腫瘤生長和肝癌細胞增殖的抑制作用研究[A];面向21世紀的科技進步與社會經(jīng)濟發(fā)展（下冊）[C];1999年

7 高金亭;鄭樹森;梁廷波;吳麗花;余松峰;金晶;吳李鳴;徐世國;;環(huán)孢素A和他克莫司聯(lián)合表阿霉素對肝癌細胞增殖、凋亡的影響[A];2005年浙江省器官移植學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2005年

8 高金亭;鄭樹森;梁廷波;吳麗花;余松峰;金晶;吳李鳴;徐世國;;環(huán)孢素A和他克莫司聯(lián)合表阿霉素對肝癌細胞增殖、凋亡的影響[A];2005年浙江省外科學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2005年

9 任開環(huán);邵榮光;;MR-1基因功能研究:促進肝癌細胞增殖、粘附和遷移[A];2009醫(yī)學(xué)前沿論壇暨第十一屆全國腫瘤藥理與化療學(xué)術(shù)會議論文集[C];2009年

10 巴一;吳雄志;謝廣茹;陳丹;王偉;;守宮硫酸多糖對人肝癌細胞增殖與分化的影響[A];第四屆中國腫瘤學(xué)術(shù)大會暨第五屆海峽兩岸腫瘤學(xué)術(shù)會議論文集[C];2006年

相關(guān)重要報紙文章 前2條

1 何德功;日發(fā)現(xiàn)致腸癌和肝癌細胞增殖的酶[N];中國勞動保障報;2004年

2 ;乙型肝炎病毒x蛋白對人肝癌細胞增殖和凋亡的影響[N];中國醫(yī)藥報;2003年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 楊思俊;癌基因RMP與抑癌基因PTEN的相互拮抗作用及其對肝癌細胞增殖的影響[D];蘇州大學(xué);2015年

2 馬孝明;MY06在肝癌細胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及機制研究[D];蘇州大學(xué);2015年

3 王貴明;SOX18基因?qū)Ω伟┘毎鲋�、遷移及侵襲作用的研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2016年

4 崔靜;ARK5在肝癌組織中的表達及對肝癌細胞增殖、凋亡和侵襲的影響[D];鄭州大學(xué);2016年

5 黃健;1,25-二羥維生素D3下調(diào)HDAC2抑制肝癌細胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用及機制研究[D];貴州醫(yī)科大學(xué);2016年

6 周彥明;曲格列酮抑制肝癌細胞增殖及其作用機制的實驗研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2007年

7 崔越宏;17AAG對肝癌細胞增殖轉(zhuǎn)移的抑制及其機制的研究[D];復(fù)旦大學(xué);2011年

8 魏雙;Ku80分子對人肝癌細胞增殖的影響及其機制的研究[D];華中科技大學(xué);2011年

9 孫慧燕;Hsa-miR-486-5p抑制肝癌細胞增殖及侵襲的作用及機制研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2012年

10 路欣;HSD17B4促進肝癌細胞增殖及其機制的研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 楊海洋;鈣通道蛋白STIM1&Orai1對肝癌細胞增殖、凋亡、侵襲作用的初步研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

2 彭云云;NLRC5靶向Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控肝癌細胞增殖、遷移和侵襲的功能及機制研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

3 黃道斌;葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78對肝癌細胞增殖、自噬及體外血管生成的影響[D];南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院;2015年

4 周勇;TLR4調(diào)控腫瘤增殖相關(guān)蛋白CDK4、CDK6對HBV相關(guān)性肝癌細胞增殖的作用[D];南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院;2015年

5 嚴曉娣;shRNA干預(yù)IGF-I受體活化對肝癌細胞增殖抑制及其分子機制研究[D];南通大學(xué);2014年

6 吳國慧;Wnt10b基因失活對人肝癌細胞增殖、周期、凋亡、遷移及侵襲的影響[D];桂林醫(yī)學(xué)院;2015年

7 代航;MicroRNA-30a-5p對肝癌細胞增殖凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移的實驗研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2015年

8 李鳳霞;Myrothecine A通過miR-221調(diào)控肝癌細胞增殖及樹突狀細胞成熟機制的研究[D];揚州大學(xué);2015年

9 肖澤林;乙肝病毒X蛋白通過SPHK1促進肝癌細胞增殖的作用及其分子機制的研究[D];南開大學(xué);2015年

10 武承鳳;MIF通過ERK信號通路對肝癌細胞增殖的實驗研究[D];甘肅中醫(yī)藥大學(xué);2016年

本文編號：2530363