【摘要】：研究背景： 高三尖杉堿酯(Homoharringtonine, cephalotaxine,4-methyl2-hydroxy-4-meth-ylpentyl butanedioate [ester],簡稱HHT,別名高粗榧堿)是從我國特有三尖杉屬植物海南粗榧(Cephalotaxus harringtonia)(常綠喬木)中分離得到的天然生物堿,在納摩爾(nanomolar concentration, nM)濃度就能殺傷腫瘤細胞,是一種非常有效的抗癌劑。在中國,HHT被用來作為急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)聯(lián)合化療方案的一個關(guān)鍵組成部分,廣泛使用已經(jīng)超過30年。 最近的一項多中心、開放、隨機對照的III期臨床試驗顯示,對于原發(fā)性AML患者,基于HHT的誘導(dǎo)方案HAA(高三尖杉酯堿+阿糖胞苷+阿柔比星)取得了較高(73%)的完全緩解率(complete remi ssion rate, CR),顯著高于目前治療AML的國際標準方案(柔紅霉素聯(lián)合阿糖胞苷)的57.3%；并且其3年無事件生存率(3-year event-free survival)為35.4%比23.1%,從而成為原發(fā)性AML的標準誘導(dǎo)緩解方案。然而,臨床上不同白血病患者對HHT的治療反應(yīng)是迥然不同的。HHT對部分患者有良好的治療效果,能達到完全緩解,但也有一部分患者不但沒有收到療效,甚至出現(xiàn)了骨髓抑制等嚴重后果。因此,尋找HHT抗白血病作用的分子靶標,并闡明其作用的具體分子機制無疑有助于最大限度發(fā)揮HHT抗白血病作用并減少HHT相關(guān)的毒副作用。 以往一些研究認為核糖體是HHT介導(dǎo)的蛋白質(zhì)翻譯抑制的候選靶標之一,其主要依據(jù)是晶體結(jié)構(gòu)研究。該研究顯示HHT與氨基酸側(cè)鏈的氨�；�-tRNA相競爭,結(jié)合在核糖體的肽基轉(zhuǎn)移酶中心的A位。然而,在此共結(jié)晶結(jié)構(gòu)模型中使用的HHT濃度為1毫摩爾(mM),這是HHT用于殺傷腫瘤細胞nM濃度的10萬倍,提示HHT結(jié)合到核糖體的親和力可能不高。不排除在這一高濃度下,HHT非特異性結(jié)合到核糖體的可能。此外,如果核糖體是HHT的一個關(guān)鍵靶標,HHT處理后應(yīng)抑制全部蛋白質(zhì)的合成。然而,文獻研究發(fā)現(xiàn)HHT選擇性地抑制一些半衰期短的致癌蛋白的合成,c-Myc, cyclin-D1, Mcl-1等,但對管家基因編碼的蛋白質(zhì),如GAPDH和β-actin并沒有明顯影響,這是核糖體作為HHT的主要靶分子所不能解釋的。因此,我們推測尚有未知的關(guān)鍵的分子靶標可能參與HHT介導(dǎo)的抗腫瘤活性。 文獻報道指出,真核翻譯起始因子4E(eukaryotic translation initiation factor4E, eIF4E)在具有短半衰期的致癌蛋白或者促生存蛋白的mRNAs轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用；并且在AML-M5患者中eIF4E過表達。巧合的是,我們最近的研究發(fā)現(xiàn)p-eIF4E水平在AML-M5患者中高度上調(diào)。結(jié)合既往的研究結(jié)果,使我們有理由相信HHT可能通過作用于p-eIF4E發(fā)揮抑制白血病細胞增殖的作用。 本研究中,我們首先應(yīng)用生物素標記的HHT分離和鑒定可能與HHT作用的eIF4E和p-eIF4E蛋白質(zhì)分子靶標,然后通過系列體外和小鼠體內(nèi)實驗手段和方法系統(tǒng)研究HHT與其靶標之間相互作用的分子機制,為明確HHT臨床應(yīng)用的適應(yīng)癥提供科學理論依據(jù)。 研究目的： 1、分離和鑒定高三尖杉堿酯抗急性髓系白血病作用的分子靶標； 2、初步闡明高三尖杉堿酯與其分子靶標p-eIF4E相互作用的分子機制； 3、明確高三尖杉堿酯對高表達分子靶標p-eIF4E的入急性髓系白血病細胞在小鼠體內(nèi)的生長抑制作用； 4、明確高三尖杉堿酯分子靶標p-eIF4E在人髓系白血病原代樣本及正常血細胞樣 本中的表達情況。 研究內(nèi)容與結(jié)果： 1. p-eIF4E是HHT抗急性髓系白血病活性的一個關(guān)鍵靶標 為了明確HHT是否特異性地影響AML細胞中的p-eIF4E水平,通過Western blotting檢測HHT對p-eIF4E和t-eIF4E的作用。用HHT處理AML-M5細胞系THP-1白血病細胞24小時導(dǎo)致p-eIF4E水平的抑制,呈劑量依賴,而t-eIF4E水平則不受影響。同樣,在原代AML細胞中也觀察到了類似結(jié)果。并且HHT對p-eIF4E水平的影響呈時間依賴。為觀察HHT是否存在抑制其他信號分子的脫靶效應(yīng),我們檢測HHT對MNKl和Mcl-1的抑制作用。在顯著抑制eIF4E磷酸化的濃度,HHT對磷酸化的MNK1沒有明顯的影響,而Mcl-1的水平則表現(xiàn)出與p-eIF4E平行的下降,表明p-eIF4E水平的下降不是非特異性毒性作用的結(jié)果。上述結(jié)果有力地表明HHT特異性地降低p-eIF4E及其下游靶蛋白Mcl-1。 為了評估HHT介導(dǎo)的p-eIF4E的減少是否與其抗白血病活性有關(guān),通過MTT試驗和Western blotting技術(shù)來研究細胞存活率和p-eIF4E蛋白下降的關(guān)系。我們用一定濃度的HHT作用THP-1細胞48小時,可以觀察到HHT介導(dǎo)的抗白血病活性和p-eIF4E抑制呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.87。為了進一步證實上述結(jié)果,接下來我們選擇了6個具有不同的抑制細胞增殖能力的HHT結(jié)構(gòu)類似物,分別檢測其在THP-1細胞的抗增殖活性和p-eIF4E的抑制作用,發(fā)現(xiàn)HHT類似物抗細胞增殖的IC50值和p-eIF4E的抑制是顯著相關(guān)的,相關(guān)系數(shù)為0.98。這些結(jié)果強有力地說明HHT可能是抑制白血病細胞生長的特異的p-eIF4E的拮抗劑。 2. HHT特異性下調(diào)白血病細胞p-eIF4E水平 為了確認上述實驗結(jié)果,我們采用生物素標記的HHT (HHT-biotin)來捕獲白血病細胞中的p-eIF4E蛋白和eIF4E蛋白。采用THP-1細胞的全細胞裂解產(chǎn)物與HHT-biotin孵育,然后用親和素磁珠來沉淀與HHT-biotin相互作用的蛋白分子復(fù)合物。經(jīng)過充分的洗滌,在沉淀產(chǎn)物中檢測到p-eIF4E和t-eIF4E.與此相一致的是,我們通過SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色實驗檢測到p-eIF4E蛋白條帶,并通過Western blotting和蛋白質(zhì)譜分析(Mass Spectroscopic analysis)得到確認。為了檢測純化的p-eIF4E蛋白是否與HHT相互作用,進一步通過pull-down實驗證實HHT-biotin是結(jié)合到p-eIF4E蛋白的。 為了揭示在白血病細胞中HHT結(jié)合p-eIF4E的細胞定位,用生物素標記的HHT(HHT-biotin)、生物素(biotin)和HHT作用THP-1細胞12小時,通過p-eIF4E抗體的免疫熒光染色,觀察其與HHT-biotin的共定位情況。結(jié)果顯示HHT-biotin在整個細胞漿和細胞核內(nèi)均有分布,但主要定位于核p-eIF4E. 為了進一步驗證上述實驗結(jié)果,我們用HHT(100ng/ml)作用THP-1細胞12h或者24h,通過免疫熒光染色來評估p-eIF4E和t-eIF4E在白血病細胞的分布。結(jié)果顯示HHT作用12小時,核p-eIF4E水平大大減少,在24小時基本消失,但t-eIF4E無明顯影響。并且我們還觀察到,伴隨核p-eIF4E的消失,HHT促進核p-eIF4E在細胞核周邊和胞漿的聚集。Western blotting實驗也顯示HHT作用能顯著降低THP-1細胞核p-eIF4E水平。這些研究結(jié)果表明,在白血病細胞,HHT主要結(jié)合于p-eIF4E,特別是核p-eIF4E。 3. p-eIF4E209位磷酸化絲氨酸是HHT結(jié)合的關(guān)鍵位點之一 為了揭示HHT結(jié)合p-eIF4E的潛在結(jié)合位點,通過計算機分子對接模型,我們發(fā)現(xiàn)201a.a.到212a.a.是HHT結(jié)合eIF4E的關(guān)鍵位點。我們模擬了25納秒(ns)時磷酸化S209(p-eIF4E)、磷酸化S209-敲除(eIF4E-△209S)與HHT的相互作用,結(jié)果顯示為了獲得更強的蛋白-配體相互作用,p-eIF4E中的環(huán)區(qū)移向HHT分子,K206的重要組成部分氧原子與HHT分子形成氫鍵。另一方面,在eIF4E-△209S內(nèi)的環(huán)區(qū)因為局部螺旋的形成而失去其靈活性,因此它與HHT分子的結(jié)合力是比較弱的。這可以通過檢查環(huán)區(qū)與HHT的最小距離來進一步說明。模擬p-eIF4E、 eIF4E和eIF4EA209S在0-25ns與HHT的相互作用,我們發(fā)現(xiàn)這個環(huán)區(qū)是靈活的,并且最終在17ns時p-eIF4E與HHT形成緊密而穩(wěn)定的作用,兩者的最小距離為2.8A；然而對于eIF4E-△209S的模擬顯示,該環(huán)區(qū)始終遠離HHT分子,距離達到8A；對于eIF4E,也沒有觀察到其與HHT穩(wěn)定的相互作用。上述分子對接模型結(jié)果表明,相比于eIF4E-△209S和eIF4E, p-eIF4E蛋白對HHT具有更大的親和力。 為了鑒定HHT結(jié)合eIF4E的具體氨基酸位點,我們構(gòu)建了一系列eIF4E的突變體,包括W56,W73,W102和Ser209缺失的突變體,通過轉(zhuǎn)染HEK293細胞檢測HHT結(jié)合到這些突變體的能力。選擇這些突變體的主要原因是W73與泛素／降解相關(guān),W56和W102涉及帽結(jié)合活性,而S209則是其磷酸化位點。結(jié)果顯示,Ser209缺失的突變體消除了eIF4E與HHT的結(jié)合,這與上述計算機模擬結(jié)果一致,而其他氨基酸殘基的突變,包括eIF4E56W,73W和102W缺失,并不影響eIF4E與HHT的結(jié)合。這些結(jié)果表明磷酸化Ser209位點是HHT結(jié)合eIF4E的關(guān)鍵,并且p-eIF4E與HHT結(jié)合的親和力遠高于eIF4E. 4.HHT通過增加SUMO化促進蛋白酶體依賴的p-eIF4E蛋白降解 已知eIF4E是小泛素化蛋白(SUMO)底物之一。為明確SUMO化修飾是否參與HHT介導(dǎo)的p-eIF4E的下降,我們評估了白血病細胞中HHT對p-eIF4E和SUMO結(jié)合酶UBC9的影響。結(jié)果顯示,HHT處理THP-1細胞3小時,p-eIF4E從細胞裂解液的上清轉(zhuǎn)移到不溶性顆粒,伴隨出現(xiàn)UBC9的增加。HHT處理24小時后,大部分的p-eIF4E從上清液轉(zhuǎn)移到不溶性顆粒,提示HHT增加p-eIF4E在髓系白血病細胞中的變性水平。這些結(jié)果與免疫熒光觀察到的結(jié)果即HHT誘導(dǎo)p-eIF4E在細胞核周邊和胞漿的聚集相一致。進一步,我們發(fā)現(xiàn)蛋白酶體抑制劑MG132強烈阻止白血病細胞中HHT誘導(dǎo)的p-eIF4E蛋白水平的下降,提示HHT可能觸發(fā)p-eIF4E的蛋白酶體依賴的降解。 接下來我們研究HHT是否通過增加SUMO化使p-eIF4E變性?使用HEK293細胞轉(zhuǎn)染表達FALG-eIF4E、FALG-eIF4E-△209S的質(zhì)粒,然后用／不用HHT處理12h。細胞裂解物用抗FALG M2磁珠進行免疫沉淀,隨后用anti-SUMO1、anti-SUMO2/3或者anti-FALG抗體通過western blotting技術(shù)進行分析。結(jié)果顯示：HHT處理后,用anti-SUMO2/3抗體檢測,發(fā)現(xiàn)野生型eIF4E在25kDa以上有多條條帶,但是在eIF4E-△209S突變卻未檢測到；而且無法用anti-SUMO1抗體檢測到上述條帶,并且HHT (100ng/ml)增加了SUMO化p-eIF4E的寡聚化。這些結(jié)果表明HHT處理增加了SUMO2/3介導(dǎo)的p-eIF4E的SUMO化。 此外,Ser209的磷酸化是HHT介導(dǎo)的p-eIF4E的SUMO化的關(guān)鍵。為了進一步明確上述結(jié)果,在白血病細胞中,我們對HHT誘導(dǎo)的UBC9結(jié)合到p-eIF4E的水平做進一步的分析,發(fā)現(xiàn)HHT增加UBC9結(jié)合到p-eIF4E,呈時間依賴。這些結(jié)果表明,HHT誘導(dǎo)SUMO2/3分子介導(dǎo)的p-eIF4E蛋白的SUMO化,通過增加UBC9與p-eIF4E的親和力,這反過來導(dǎo)致p-eIF4E蛋白酶體依賴的降解。因此,我們提出HHT誘導(dǎo)p-eIF4E降解的工作模型：HHT特異性結(jié)合到p-eIF4E的201-212a.a.,導(dǎo)致構(gòu)象變化,這有利于p-eIF4E的寡聚化和SUMO化,最終導(dǎo)致蛋白酶體依賴的降解。 5. HHT對p-eIF4E高表達的人AML-M5原位小鼠移植瘤的生長抑制作用 為了獲得HHT根除p-eIF4E高表達的AML細胞的體內(nèi)證據(jù),我們把表達高水平p-eIF4E的THP-1細胞注射到NSG小鼠體內(nèi),建立了具有侵襲性的人AML-M5原位小鼠模型。每天按0.5mg或1.0mg/kg體重的HHT劑量腹腔給藥,1天1次,連續(xù)14天。經(jīng)過HHT處理大大降低了白血病負荷,并且生存時間延長,呈現(xiàn)劑量依賴。用高劑量HHT(1.0mg/kg體重)可以完全根除小鼠體內(nèi)的AML-M5細胞,且到80天時所有小鼠仍處于無病生存。這些結(jié)果表明HHT結(jié)合于p-eIF4E,使其具有根除表達高水平p-eIF4E的AML的潛能。 6. p-eIF4E在部分AML患者中異常上調(diào),而在正常個體中未見表達或低表達 已有文獻指出eIF4E在部分白血病患者中是高表達的,但p-eIF4E在人急性髓系白血病患者中是否表達目前未見任何報道。因此,我們通過western blotting技術(shù)檢測了7例人AML細胞系,16例不同的AML原代樣本,20例健康成年捐贈的正常造血細胞樣品中的p-eIF4E和eIF4E蛋白水平。結(jié)果顯示7例AML細胞均表達高水平的p-eIF4E和eIF4E蛋白,16例原代樣本中有13例(81.25%)表達高水平的p-eIF4E和eIF4E蛋白,但在20例健康成年中,8例表達低水平的p-eIF4E蛋白,12例不表達p-eIF4E蛋白。上述結(jié)果表明,相比于正常個體,p-eIF4E蛋白水平在部分AML患者中是高度上調(diào)的。 研究結(jié)論： 1. p-eIF4E是HHT抗急性髓系白血病作用的重要靶標之一； 2. p-eIF4E絲氨酸209位磷酸化是HHT結(jié)合的關(guān)鍵位點之一； 3. HHT通過增強SUMO化途徑促進p-eIF4E進行蛋白酶體依賴的降解； 4.HHT能清除原位NSG小鼠模型體內(nèi)高表達p-eIF4E的人急性單核細胞白血病 細胞； 5. p-eIF4E在部分急性髓系白血病患者原代白血病細胞樣本中呈高表達狀態(tài)。
【圖文】：

圖2.1 p-eIF4E在原代AML-M5白血病細胞中高表達p-eIF4E的免疫焚光染色：A為原代AML-M5細胞；B為正常jk細胞(綠色：p-eIF4E藍色：細胞核DAPI染色）為進一步探討小分子化合物HHT抗急性髓系白血病作用的分子耗標，以biotin-HHT為分子探針，聯(lián)合應(yīng)用蛋白質(zhì)譜MS和werestn blotting技術(shù)和方法篩選并鑒定HHT特異性的作用祀標。還將利用動態(tài)計算機分子對接模型（DynamicComputer Molecular Docking Model)模擬HHT與p-eIF4E發(fā)生特異性結(jié)合的具體對接位點，并且探討HHT對其把分子的抑制作用。2.2材料與方法2.2.1實驗材料

活率=(用藥孔0D值-調(diào)零孔0D值)/(對照孔0D值-調(diào)零孔0D值）xlOO%果p-eIF4E是HHT抗急性髓系白血病活性的一個關(guān)鍵乾標了明確HHT是否特異性地影響AML細胞中的p-eIF4E水平，通過Westerng檢測HHT對p-eIF4E和t-eIF4E的作用。用不同濃度HHT處理AML-M5THP-1白血病細胞24小時可見p-eIF4E水平隨著HHT濃度的增加而不斷呈劑量依賴（圖2.2)。相反，t-eIF4E水平在不同濃度HHT處理下是不受影圖2.2)。同樣，在原代AML細胞中也觀察到了類似結(jié)果(圖2.3)。并且我們western blotting實驗進一步發(fā)現(xiàn)HHT lOOng/ml作用于THP-1細胞，p-eIF4E著作用時間延長而不斷下降，表明HHT對p-dF4E蛋白的影響是呈時間依（圖2.4)。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R733.71

【共引文獻】

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3 廖W，

本文編號：2529592