發(fā)布時間：2019-08-15 07:00

【摘要】：目前越來越多的報道揭示了細(xì)胞自噬在細(xì)胞生理過程中的重要作用和意義,細(xì)胞自噬的異常以及功能性障礙往往與人的各種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及惡性行為密切相關(guān)。然而目前為止,關(guān)于細(xì)胞自噬在人的各種惡性腫瘤中發(fā)揮作用的細(xì)胞和分子機(jī)制人們還不是十分明確,更進(jìn)一步的研究十分需要而且非常有意義,在各類腫瘤中,細(xì)胞自噬在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中的作用更是知之甚少。目前為止,科學(xué)家的研究顯示,人體細(xì)胞自噬是機(jī)體正常機(jī)能的體現(xiàn),異常的細(xì)胞自噬狀況往往與人體機(jī)能紊亂、疾病的高發(fā)有關(guān),已有證據(jù)顯示人體神經(jīng)系統(tǒng)的異常、人體細(xì)胞老化和人體老齡化速度加快、癌癥的發(fā)生都與異常的細(xì)胞自噬相聯(lián)系。在人體癌癥的發(fā)生中細(xì)胞自噬究竟扮演何種角色,人們廣泛關(guān)注和研究,然而由于其作用機(jī)制復(fù)雜,在整個癌癥的起始、發(fā)生、發(fā)展、惡性變異過程中細(xì)胞自噬發(fā)揮的功能不盡相同,因此該課題引發(fā)科學(xué)界的爭論和探討。細(xì)胞自噬促進(jìn)機(jī)體細(xì)胞對于惡劣環(huán)境的適應(yīng),對于癌細(xì)胞,細(xì)胞自噬的這一基本功能同樣適用,因此從一定程度上來講,細(xì)胞自噬具有促進(jìn)癌適應(yīng)、生長的作用。面對正常機(jī)體對于癌細(xì)胞的排斥以及治療過程中藥物等制造的惡劣環(huán)境,細(xì)胞自噬幫助癌細(xì)胞生存和適應(yīng)。然而對于癌細(xì)胞的起始過程,由于細(xì)胞自噬幫助機(jī)體正常細(xì)胞清理廢舊物質(zhì)加以循環(huán)利用,減少了致癌物質(zhì)的堆積,幫助機(jī)體維持酸堿平衡等,因此從這個角度來看細(xì)胞自噬對于癌細(xì)胞的起始有抑制作用。在人體大部分種類的癌癥中,細(xì)胞自噬都發(fā)揮著重要作用,這從各種癌癥中細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的異常和介導(dǎo)的功能可以找到答案。Beclin-1,LC3B,p62等就是研究的比較多的細(xì)胞自噬基因,Beclin-1在許多種類的人體癌癥中發(fā)揮著抑癌作用,而LC3B,p62在許多種類的人體癌癥中發(fā)揮著促癌作用。在本課題中,我們收集了視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤病人經(jīng)福爾馬林固定和石蠟包埋的腫瘤組織,通過組織切片利用免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法檢測了細(xì)胞自噬標(biāo)志性蛋白LC3(微管相關(guān)蛋白輕鏈3B)和p62(SQSTM1),進(jìn)一步進(jìn)行各種臨床病理學(xué)特征與這兩種蛋白表達(dá)量的組合相關(guān)分析,研究細(xì)胞自噬行為在人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中的作用。更進(jìn)一步,我們分析了在人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織中LC3B和p62彼此之間的內(nèi)在聯(lián)系,以及它們與p53蛋白之間的相關(guān)性,p53蛋白是近些年新發(fā)現(xiàn)的能夠抑制細(xì)胞自噬作用的蛋白。在細(xì)胞自噬的研究中,lc3b往往用來衡量lc3蛋白的表達(dá),而lc3蛋白是目前被普遍接受的細(xì)胞自噬標(biāo)記蛋白。同時p62也是經(jīng)常用來檢測細(xì)胞自噬過程的標(biāo)記蛋白,p62蛋白在細(xì)胞自噬過程中主要在降解代謝廢物中發(fā)揮具體功能。在細(xì)胞自噬過程中,lc3與p62蛋白分別在上下游過程中發(fā)揮具體功能,它們的聯(lián)合檢測也成為評價細(xì)胞自噬活性的一個指標(biāo)。針對該二者的檢測,通過蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)可以檢測不同細(xì)胞中它們的表達(dá)水平差異,表達(dá)水平高代表著細(xì)胞自噬活性高,反之代表細(xì)胞自噬活性低;利用免疫熒光實(shí)驗(yàn)可以將這兩個蛋白表達(dá)陽性的細(xì)胞用熒光標(biāo)記出來,通過在熒光顯微鏡下可以直觀檢測到該兩種蛋白陽性的細(xì)胞,也就是代表了發(fā)生細(xì)胞自噬的細(xì)胞;近來,免疫組織化學(xué)技術(shù)在組織切片中檢測這兩個蛋白的表達(dá)也成為一種重要的方法,而且該技術(shù)也不斷完善,而且可以與組織病理學(xué)和形態(tài)學(xué)相聯(lián)系。在正常人體細(xì)胞中,p53基因參與了染色質(zhì)的損傷修復(fù)、細(xì)胞分裂周期、細(xì)胞程序性死亡等過程,對于維持細(xì)胞正常的細(xì)胞周期十分重要,作為一個調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄過程的功能性基因,p53已經(jīng)被證明并被普遍認(rèn)可是一個重要的腫瘤抑制基因。對于細(xì)胞自噬,有報道顯示p53基因也發(fā)揮了一定功能,而在細(xì)胞自噬過程中發(fā)揮作用的p53主要是細(xì)胞質(zhì)p53蛋白。同時為了探討p53調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的上游調(diào)控機(jī)制,本研究進(jìn)一步通過生物學(xué)預(yù)測加實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方法,篩選了調(diào)節(jié)p53乃至自噬的靶向mirna。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分證明lc3b和p62蛋白的表達(dá)水平與人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展以及惡性侵襲具有顯著正相關(guān)性。而且我們證實(shí)了p53蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)水平與惡性視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的侵襲能力具有顯著負(fù)相關(guān)性。p53蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)水平與lc3b和p62蛋白二者之間的表達(dá)水平具有顯著負(fù)相關(guān)特征,這是通過spearman相關(guān)性分析得到的。體外研究發(fā)現(xiàn),p53可以下調(diào)lc3b和p62表達(dá),進(jìn)而抑制人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的自噬進(jìn)程;并且,生物學(xué)預(yù)測結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證顯示p53是mir-337的靶基因,mir-337通過下調(diào)細(xì)胞p53表達(dá)促進(jìn)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的自噬進(jìn)程。因此,我們可以得出結(jié)論,細(xì)胞自噬在人的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中發(fā)揮著重要作用,它能夠促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展和惡性行為,在此過程中l(wèi)c3b和p62的表達(dá)水平可以作為疾病發(fā)展預(yù)測和診斷的指標(biāo)。此外我們證明了在人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞中p53能夠抑制atg5,atg7,atg12,beclin1,lc3,p62等基因的表達(dá),從而發(fā)揮抑制細(xì)胞自噬的功能。miR-337能夠靶向抑制調(diào)節(jié)p53基因,在人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞中發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞自噬功能。
【圖文】：

圖2.1 SYBR Green 法熒光實(shí)時定量 PCR準(zhǔn)備熒光實(shí)時定量 PCR 反應(yīng)專用的 PCR 管（八聯(lián)管），按照每檢測一個樣本的一個基因 3 個重復(fù)孔進(jìn)行標(biāo)記好。配制反應(yīng)混合物，大概包括 ROX 染色劑，SYBR Green 反應(yīng)酶，待檢測基因的正反向引物，模板 RT 產(chǎn)物（cDNA），用雙蒸水稀釋按照試劑說明書配制每孔20 微升系統(tǒng)的反應(yīng)液。利用熒光實(shí)時定量 PCR 儀進(jìn)行反應(yīng)，一般選擇 40 循環(huán)，利用溶解曲線判斷 PCR 反應(yīng)的特異性程度。利用統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。所用引物如下：Name Sequence5'-3'GAPDH sense 5'- TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'antisense 5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'ATG5 sense 5'-AGAATAGCCAGTACAGCA-3'

安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文片的組織塊大小不能太大，一般大小不能超過 2 厘米，，厚度不能超過 4本制作第二步是固定，組織固定要選取合適的固定液，一般選擇 10%甲為組織標(biāo)本的固定液，固定時間要恰到好處，一般固定 3-12 小時，時間固定不充分，時間太長固定液福爾馬林會產(chǎn)生福爾馬林色素，對后續(xù)免學(xué)染色造成干擾，而且固定時間太長還會降低組織的抗原的活性，對免學(xué)中抗原抗體的特異性反應(yīng)造成影響。（甲醛溶液：中國國藥集團(tuán)試劑
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R739.7

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本文編號：2526832