【摘要】：白血病系造血系統(tǒng)的一種惡性疾病,又稱血癌,預(yù)后較差。近十年來,我國的白血病發(fā)病率、死亡人數(shù)均呈逐年上升趨勢(shì),平均每年增加10%左右,白血病已成為危害我國人民生命和健康的重要疾病。在我國急性白血病比慢性白血病多見(約5.5:1),在急性白血病中又以急性髓細(xì)胞白血病(AML)為主,如得不到有效治療,病程進(jìn)展迅速,短者數(shù)天就能引起患者死亡。AML是一種異質(zhì)性、多基因的病變,有150多個(gè)癌基因與白血病的發(fā)生密切相關(guān),其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜;病理學(xué)特征主要表現(xiàn)為白血病細(xì)胞增殖過度、分化障礙、凋亡受阻、老化缺陷。長(zhǎng)期以來,AML的治療是以化療為主,主要是通過抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)細(xì)胞分化三方面起作用,但對(duì)誘導(dǎo)白血病細(xì)胞老化缺乏研究。臨床現(xiàn)有AML藥物由于特異性差,毒性大,易產(chǎn)生耐藥性,常導(dǎo)致AML療效不佳和白血病復(fù)發(fā),AML的治療仍面臨挑戰(zhàn),亟需研發(fā)出新的抗白血病有效藥物。在正常個(gè)體,骨髓造血干細(xì)胞分化成各種血系的終末細(xì)胞和發(fā)揮其功能后,細(xì)胞就啟動(dòng)了一個(gè)完全老化的過程,表現(xiàn)為不可逆的細(xì)胞生長(zhǎng)停滯、程序性的細(xì)胞死亡,最終被機(jī)體的免疫系統(tǒng)清除。而白血病細(xì)胞中通常發(fā)生老化缺陷,細(xì)胞不能進(jìn)入完全老化程序,腫瘤細(xì)胞變?yōu)橛郎�。同時(shí),也有部分白血病細(xì)胞發(fā)生不成熟老化,表現(xiàn)為暫時(shí)的細(xì)胞周期阻滯,細(xì)胞處于一種休眠的狀態(tài)。但不幸的是多種致癌因素能夠重新激活這種不成熟老化細(xì)胞,引起細(xì)胞惡性增殖,導(dǎo)致白血病復(fù)發(fā)。目前臨床上誘導(dǎo)白血病細(xì)胞老化的有效藥物缺如。在這種嚴(yán)峻的形勢(shì)下,因此我們提出了白血病治療的科學(xué)問題:誘導(dǎo)白血病細(xì)胞老化是否能夠有效地抗白血病?中醫(yī)藥是我國偉大的寶庫,我們能否從醫(yī)藥寶庫中發(fā)掘新型抗白血病藥物?根據(jù)我們的前期研究結(jié)果,我們提出了一個(gè)科學(xué)假設(shè):通過誘導(dǎo)白血病細(xì)胞完全老化,能夠有效地抗白血病;并設(shè)計(jì)了一系列的實(shí)驗(yàn)來研發(fā)能夠誘導(dǎo)白血病細(xì)胞完全老化的抗白血病藥物。近年來,我們采用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù),從祖國醫(yī)藥寶庫中發(fā)掘新型抗癌藥物,應(yīng)用急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞模型,在國內(nèi)外首先發(fā)現(xiàn)中草藥單體雷公藤內(nèi)酯酮(Triptonide)能夠誘導(dǎo)人原髓細(xì)胞白血病細(xì)胞HL60和人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞U937完全老化,并顯著抑制白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)和致瘤性,發(fā)揮抗癌效應(yīng),且毒性小。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:(1)中草藥單體雷公藤內(nèi)酯酮能夠顯著抑制HL60和U937細(xì)胞的生長(zhǎng)和集落生成,其半數(shù)抑制濃度分別為11.8和7.5 nM;體內(nèi)小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)顯示雷公藤內(nèi)酯酮幾乎能完全抑制HL60細(xì)胞的致瘤能力,抑瘤率大于99%。(2)雷公藤內(nèi)酯酮能夠誘導(dǎo)HL60和U937細(xì)胞體積增大、細(xì)胞核難以分裂、細(xì)胞核中顆粒增多,細(xì)胞出現(xiàn)老化的形態(tài)學(xué)改變;雷公藤內(nèi)酯酮能夠誘導(dǎo)HL60和U937細(xì)胞老化相關(guān)β-半乳糖苷酶(β-gal)活性染色和老化相關(guān)異染色質(zhì)集落(SAHF)形成。(3)機(jī)制研究顯示,雷公藤內(nèi)酯酮通過抑制端粒逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)的啟動(dòng)子活性和c-Myc轉(zhuǎn)錄因子(促進(jìn)TERT基因的轉(zhuǎn)錄)的表達(dá),使TERT基因在白血病中的表達(dá)降低;同時(shí)上調(diào)抑癌基因p16和p21的表達(dá),促進(jìn)白血病細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)細(xì)胞老化。此外,雷公藤內(nèi)酯酮還能上調(diào)白血病細(xì)胞中促凋亡基因-DNA損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子3(DDIT3)的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這些效應(yīng)均是由于雷公藤內(nèi)酯酮選擇性地激活白血病細(xì)胞中絲裂原活化蛋白激酶-3(MKK3)/p38信號(hào)通路介導(dǎo)的,最終使白血病細(xì)胞完全老化,發(fā)揮抗癌效應(yīng)。綜上所述,雷公藤內(nèi)酯酮通過抑制白血病細(xì)胞中老化關(guān)鍵基因TERT的表達(dá)、上調(diào)老化重要基因p16和p21的表達(dá),同時(shí)激活MKK3-p38-DDIT3信號(hào)通路,誘導(dǎo)白血病細(xì)胞完全老化,導(dǎo)致老化細(xì)胞凋亡,發(fā)揮抗癌效應(yīng)。我們的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)我們的科學(xué)假說,通過誘導(dǎo)白血病細(xì)胞完全老化能夠有效地抗白血病。這為新一代抗白血病藥物的研發(fā)提供了新的研究策略和候選藥物。
【圖文】：

圖1：PGL4.17圖譜ERT 基因和 DDIT3 基因啟動(dòng)子活性的測(cè)定（化學(xué)發(fā)光實(shí)驗(yàn)）組質(zhì)粒的細(xì)胞轉(zhuǎn)染：正常培養(yǎng) HL60 細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，離心細(xì)胞連同 3ug 重組質(zhì)粒和 1ug 內(nèi)參共同加入到 100ul 電轉(zhuǎn)液中轉(zhuǎn)染進(jìn) HL60 細(xì)胞。PGL4.17 質(zhì)粒作為陰性對(duì)照，PGL4.51 質(zhì)電轉(zhuǎn)杯置于 Lonza 細(xì)胞核電轉(zhuǎn)儀中，啟動(dòng)電穿孔程序。程序六孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，48h 后更換含有 500ng/ml G418 的 1640選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的陽性 HL60 細(xì)胞株。陽性 HL60 的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于 6 孔板中，然后分別用酯酮處理細(xì)胞，于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 72 小時(shí)。收集藥物作用后的細(xì)胞制備蛋白裂解液，，分別取 20 μL 進(jìn)行化加入熒光素酶底物后反應(yīng) 5 秒，立即用化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行熒光化學(xué)發(fā)光熒光值。

雷公藤內(nèi)酯酮非常顯著地抑制HL60細(xì)胞和U937細(xì)胞集落形成能力
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R733.71

【引證文獻(xiàn)】

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1 徐佳穎;黃越燕;;毒性中藥治療惡性腫瘤的研究概況[J];中國民族民間醫(yī)藥;2017年21期

本文編號(hào)：2526152