【摘要】：背景：神經(jīng)膠質(zhì)瘤(以下簡(jiǎn)稱(chēng)膠質(zhì)瘤)是起源于神經(jīng)外胚層的最常見(jiàn)的顱內(nèi)惡性腫瘤,約占顱內(nèi)腫瘤總數(shù)的一半。膠質(zhì)瘤具有手術(shù)難以完全切除、放化療效果不明顯、易復(fù)發(fā)及預(yù)后差的特點(diǎn)。MicroRNA (miRNA)是一類(lèi)通過(guò)轉(zhuǎn)錄后抑制靶基因表達(dá)的非編碼小分子RNA。越來(lái)越多的研究表明,miRNA廣泛調(diào)控了惡性腫瘤的多種生物學(xué)特性。然而,miRNA在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用研究甚少。因此,研究miRNA在膠質(zhì)瘤中的作用和機(jī)制對(duì)于進(jìn)一步闡釋膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制以及對(duì)于膠質(zhì)瘤的診斷和治療具有重要的臨床意義。目的：本研究的主要目的是篩選在膠質(zhì)瘤中具有差異性表達(dá)的miRNA;找到幾個(gè)可能調(diào)控膠質(zhì)瘤生物學(xué)特性及抗藥性的miRNA;通過(guò)生物信息學(xué)軟件尋找其作用的靶基因并進(jìn)行相關(guān)分子機(jī)制研究。方法：(1)根據(jù)已報(bào)道文獻(xiàn)中的miRNA芯片結(jié)果,首先找出與正常對(duì)照組相比在膠質(zhì)瘤中表達(dá)下調(diào)的多種miRNA。然后通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)篩選能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U251細(xì)胞活性的miRNA。通過(guò)生物信息學(xué)軟件miRanda和DIANA microT v3.0進(jìn)一步尋找篩選后的miRNA可能的調(diào)控靶基因。(2)收集武漢大學(xué)人民醫(yī)院2011至2014年手術(shù)切除的16例IV級(jí)膠質(zhì)瘤標(biāo)本。對(duì)照來(lái)源于8例腦外傷病人所切除的腦組織。然后通過(guò)qPCR檢測(cè)對(duì)照腦組織、膠質(zhì)瘤組織以及U87和U251細(xì)胞系中miR-129和miR-873的表達(dá)水平。(3)在人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U251中過(guò)表達(dá)miR-129后,通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖；通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；通過(guò)qPCR、Western blot、共聚焦、透射電鏡以及裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-129對(duì)U87和U251自噬水平的影響。(4)通過(guò)luciferase實(shí)驗(yàn)、qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-129對(duì)Notch-1的靶向調(diào)控作用。通過(guò)qPCR和Western blot檢測(cè)miR-129對(duì)mTOR磷酸化以及E2F7和Beclin-1表達(dá)的影響。通過(guò)Western blot檢測(cè)Notch-1對(duì)E2F7和Beclin-1表達(dá)的影響以及E2F7對(duì)Beclin-1表達(dá)的影響。(5)構(gòu)建U87和U251的順鉑耐藥株,分別命名為U87/DDP和U251/DDP。通過(guò)qPCR找出在順鉑耐藥株和野生株中具有表達(dá)差異的miRNA。通過(guò)MTT法檢測(cè)miR-873對(duì)順鉑耐藥株細(xì)胞增殖的影響。通過(guò)MTT法和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在順鉑作用下miR-873對(duì)細(xì)胞活性和細(xì)胞增殖的影響；并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和caspase-3/7活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在順鉑作用下miR-873對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。(6)通過(guò)luciferase實(shí)驗(yàn)、qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-873對(duì)Bcl-2的靶向調(diào)控作用。通過(guò)MTT、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)和qPCR和caspase-3/7活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Bcl-2在miR-873致膠質(zhì)瘤細(xì)胞順鉑增敏中的介導(dǎo)作用。結(jié)果：(1)從多篇已報(bào)道文獻(xiàn)miRNA芯片結(jié)果中找出8個(gè)在膠質(zhì)瘤中表達(dá)下調(diào)的miRNA,它們分別是miR-128、miR-129、miR-133a、miR-13、miR-153、miR-323、 miR-488和miR-873。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-129和miR-873能明顯抑制U87和U251的細(xì)胞活性。通過(guò)生物信息學(xué)軟件miRanda和DIANA microT v3.0預(yù)測(cè)到miR-129可能調(diào)控Notch-1和Bcl-2等多種腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)；并且預(yù)測(cè)到miR-873可能靶向調(diào)控Bcl-2等多種腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)。(2) qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照腦組織相比,miR-129和miR-873在膠質(zhì)瘤組織及細(xì)胞系中的表達(dá)水平顯著降低。(3)過(guò)表達(dá)miR-129不但抑制U87和U251細(xì)胞的增殖和促進(jìn)其凋亡,還提高了細(xì)胞的自噬水平。抑制內(nèi)源性miR-129的活性可以有效抑制雷帕霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬水平。裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明,注射Lv-miR-129組的裸鼠較注射Lv-NC或PBS組的裸鼠腫瘤體積變小,且腫瘤組織中LC3和Beclin-1水平明顯增加。(4) Luciferase實(shí)驗(yàn)、qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-129可以靶向調(diào)控Notch-1的表達(dá)。另外,miR-129可以通過(guò)Notch-1/mTOR或Notch-1/E2F7/Beclin-1兩種途徑影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的自噬水平。(5)miR-873在U87/DDP和U251/DDP細(xì)胞中表達(dá)明顯下調(diào)。過(guò)表達(dá)miR-873可以抑制U87/DDP和U251/DDP細(xì)胞的增殖并且促進(jìn)其凋亡。在順鉑作用下,miR-873可以增加順鉑對(duì)U87/DDP和U251/DDP細(xì)胞的殺傷作用。(6)Luciferase實(shí)驗(yàn)、qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-873可以靶向調(diào)控Bcl-2的表達(dá)。另外,miR-873通過(guò)靶向調(diào)控Bcl-2增加順鉑對(duì)膠質(zhì)瘤耐藥株的殺傷作用。結(jié)論：本研究發(fā)現(xiàn),miR-129和miR-873在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)降低,過(guò)表達(dá)miR-129或miR-873不但能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖還促進(jìn)其凋亡。另外,miR-129可以通過(guò)Notch-1/mTOR或Notch-1/E2F7/Beclin-1兩種途徑促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的自噬水平。miR-873通過(guò)靶向調(diào)控Bcl-2增加順鉑對(duì)膠質(zhì)瘤耐藥株的殺傷作用。
【圖文】：

本作為實(shí)驗(yàn)組和８例腦外傷病人所切除的腦組織作為對(duì)照組。通過(guò)ｑＰＣ民檢測(cè)逡逑ｍｉＲ－１２９和ｍｉ艮－８巧在膠質(zhì)瘤和對(duì)照腦組織中的表達(dá)水平。結(jié)果表明，ｍｉＲ－１２９逡逑和ｍｉＲ－８７３在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)顯著降低（見(jiàn)圖１－２和圖１－３）。逡逑１４逡逑

再將收集的上清液和５邋ｕｇ／ｍｌ的ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ邋—同加入到Ｕ８７或Ｕ２５１細(xì)胞中。逡逑４８小時(shí)后分別通過(guò)巧光顯微鏡和流式檢測(cè)其感染效率。巧光顯微鏡下觀察絕大逡逑部分細(xì)胞都發(fā)綠光，且流式分析結(jié)果提巧感染效率達(dá)到９０％Ｗ上（見(jiàn)圖２－１邋Ａ和逡逑Ｃ）。接下來(lái)用ｑＰＣＲ檢測(cè)在Ｕ８７和Ｕ２５１中感染Ｌｖ－ＮＣ和Ｌｖ－ｍｉＲ－１２９后ｍｉＲ－１２９逡逑的表達(dá)效率。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在感染Ｌｖ－ｍｉＲ－１２９的４８小時(shí)后，ｍｉＲ－１２９在兩種逡逑細(xì)胞系中的表達(dá)水平均提高１０００－１５００倍（化圖２－１邋Ｂ）。在Ｕ８７細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染逡逑ＳＣＲ邋ｓｐｏｎｇｅ和１２９邋ｓｐｏｎｇｅ，邋４８小時(shí)后進(jìn)行（ｉＰＣＲ檢測(cè)。結(jié)果提示，１巧ｓｐｏｎｇｅ逡逑可Ｗ明顯抑制ｍｉＲ－１２９的表達(dá)，證明１巧ｓｐｏｎｇｅ質(zhì)粒構(gòu)建成功（見(jiàn)圖２－１邋Ｄ）。逡逑NB邐Ｂ逡逑ＧＦＰ邐Ｆｌｏｃｈｅｓｔ邐Ｍｅｒｇｅ邐｜邐Ｓ：心邋１，，逡逑Ｉ邋ｉｒｌ－ｄｉ逡逑Ｃ邐Ｄ。逡逑心邐ＷＴ邐ＮＣ邐ｍｉＲ－１２９邐｜逡逑ｔＥ迎碰逡逑邐Ｉ：邐ｒ邐Ｉ邐／邋／逡逑ＦＩＴＣ邐爭(zhēng)奪４逡逑圖２－１在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)和拆制ｍ化－１巧的效率。（Ａ）巧光顯微鏡觀察感染Ｌｖ－ＮＣ和逡逑Ｌｖ－ｍｉＲ－１２９的４８小時(shí)后的感染效率．（Ｂ）邋ｑＰＣＲ檢測(cè)感染Ｌｖ－ＮＣ和Ｌｖ－ｍ化－１２９的４８小逡逑時(shí)后ｍｉＲ－１２９的表達(dá)效率，＊＊Ｐ邋＜邋０．０１。（邋Ｃ邋）流式分析感染Ｌｖ－ＮＣ和Ｌｖ－ｍＵｌ－ｌ巧的４８小逡逑４６逡逑
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R739.41

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 周志華;易良;卞修武;;膠質(zhì)瘤干細(xì)胞研究進(jìn)展[J];中華病理學(xué)雜志;2007年03期

2 徐俊杰;于洪泉;國(guó)巍;趙偉;金宏;溫娜;齊玲;;西蘭花多肽對(duì)大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響[J];中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志;2012年11期

3 徐俊杰;于洪泉;趙偉;金宏;溫娜;齊玲;劉興吉;;西蘭花多肽對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用[J];吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2013年01期

4 仝海波,江澄川,唐鎮(zhèn)生,金一尊;膠質(zhì)瘤細(xì)胞化學(xué)增敏作用實(shí)驗(yàn)研究[J];山西臨床醫(yī)藥;2000年07期

5 李嗍,王楓,繆珊,駱文靜;過(guò)量鋅對(duì)鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外生長(zhǎng)的影響[J];解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2001年04期

6 梁一鳴,郭國(guó)慶,鄭少俊,沈偉哉;膠質(zhì)瘤血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的調(diào)節(jié)[J];臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志;2001年02期

7 曲元明,韓韜,李桂林,王成偉;血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子抗體對(duì)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的影響[J];山東醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2001年02期

8 黃強(qiáng),董軍;膠質(zhì)瘤的分子外科治療[J];中國(guó)微侵襲神經(jīng)外科雜志;2001年04期

9 葉明,周岱,周幽心,王瑋,傅建新,黃煜倫;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)[J];腫瘤;2002年06期

10 顧宇翔,陳銜城,王宇倩;膠質(zhì)瘤對(duì)親細(xì)胞非均質(zhì)分子脂質(zhì)和幾種藥物敏感性的比較[J];復(fù)旦學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2003年02期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 李飛;李梅;盧佳友;朱剛;林江凱;孟輝;吳南;陳志;馮華;;脂質(zhì)微區(qū)干擾劑甲基-β-環(huán)糊精影響C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移的體外實(shí)驗(yàn)研究[A];中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)神經(jīng)外科醫(yī)師分會(huì)第四屆全國(guó)代表大會(huì)論文匯編[C];2009年

2 吳安華;王運(yùn)杰;Ohlfest JR;Wei Chen;Low WC;;膠質(zhì)瘤的生物治療-從實(shí)驗(yàn)室到臨床[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)外科學(xué)分會(huì)第九次學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2010年

3 徐宏;韓楊云;孫中書(shū);李新軍;;與膠質(zhì)瘤代謝通路相關(guān)的候選基因篩選[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)外科學(xué)分會(huì)第九次學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2010年

4 潘冬生;;多基因修飾膠質(zhì)瘤細(xì)胞疫苗的抗腫瘤免疫反應(yīng)[A];中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)神經(jīng)外科醫(yī)師分會(huì)第六屆全國(guó)代表大會(huì)論文匯編[C];2011年

5 俞文華;車(chē)志豪;張祖勇;許培源;陸鏞民;傅林;朱強(qiáng);陳鋒;杜權(quán);;骨橋蛋白在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)及其信號(hào)傳導(dǎo)途徑[A];2005年浙江省神經(jīng)外科學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2005年

6 張震;徐克;;低強(qiáng)度超聲誘導(dǎo)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的體外實(shí)驗(yàn)研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十三次全國(guó)超聲醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2013年

7 蔣偉峰;高方友;尹浩;;白細(xì)胞介素-17及其受體在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及臨床意義[A];2013年貴州省神經(jīng)外科年會(huì)論文集[C];2013年

8 徐慶生;張小兵;周永慶;;膠質(zhì)瘤干細(xì)胞及其放療敏感性[A];2011年浙江省神經(jīng)外科學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2011年

9 楊孔賓;趙世光;劉炳學(xué);陳曉豐;戴欽舜;;K~+通道阻斷劑四乙胺對(duì)大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和凋亡影響[A];中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)神經(jīng)外科醫(yī)師分會(huì)第四屆全國(guó)代表大會(huì)論文匯編[C];2009年

10 黃強(qiáng);;膠質(zhì)瘤生成細(xì)胞研究[A];第三屆中國(guó)腫瘤學(xué)術(shù)大會(huì)教育論文集[C];2004年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前5條

1 衣曉峰　馮宇曦;中藥三氧化二砷有望成為治療膠質(zhì)瘤新藥[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2011年

2 記者 匡遠(yuǎn)深;讓膠質(zhì)瘤干細(xì)胞不再“繁殖”[N];健康報(bào);2011年

3 張獻(xiàn)懷　張文;瘤區(qū)埋雷 持續(xù)殺傷[N];健康報(bào);2007年

4 白毅;人腦膠質(zhì)瘤基礎(chǔ)與應(yīng)用研究喜結(jié)“九大碩果”[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2006年

5 王德江；劉藏；王貴懷；曹勇；王新生；肖新如;交流最新進(jìn)展 提高診治水平[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2005年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 董軍;CUL4B在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的作用研究[D];山東大學(xué);2015年

2 張睿;循環(huán)miR-221/222在膠質(zhì)瘤診斷與預(yù)后中的價(jià)值與基于CED的中樞神經(jīng)系統(tǒng)給藥新方法的研究[D];山東大學(xué);2015年

3 許森林;ALDH1A1在膠質(zhì)瘤侵襲和結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的作用和機(jī)制[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

4 王嘯;靶向嵌段共聚物膠束在膠質(zhì)瘤磁共振成像、藥物輸送及治療的應(yīng)用[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

5 廖紅展;鋅指轉(zhuǎn)錄因子SNAI2在miR-203的影響下通過(guò)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化參與膠質(zhì)瘤耐藥機(jī)制的調(diào)節(jié)[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

6 潘俊;IRG1促進(jìn)膠質(zhì)瘤增殖的作用機(jī)制及臨床意義[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

7 鄭傳宜;膠質(zhì)瘤中GLUT3基因異常表達(dá)的意義及其相關(guān)調(diào)控機(jī)制[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

8 徐紅超;氬氦冷凍消融聯(lián)合GM-CSF治療膠質(zhì)瘤小鼠的療效及其對(duì)小鼠脾臟樹(shù)突狀細(xì)胞免疫功能影響[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

9 黃素寧;TNFRSF6B在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及凋亡的作用研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

10 熊偉;GBE1在人腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的表達(dá)及干預(yù)實(shí)驗(yàn)研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 張大慶;單核細(xì)胞趨化蛋白-1在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向膠質(zhì)瘤細(xì)胞趨化中的作用研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2012年

2 黃俊龍;ADC值與膠質(zhì)瘤Ki-67、MGMT的相關(guān)性研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

3 李明聰;下調(diào)Pygo2對(duì)U251及U251起源的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

4 徐云峰;膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的3D培養(yǎng)及其核酸適體篩選的探索[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

5 張靜文;T細(xì)胞過(guò)繼免疫治療小鼠腦膠質(zhì)瘤原位模型的研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

6 洪宇;膠質(zhì)瘤瘤周水腫、病理級(jí)別、Ki-67表達(dá)三者相關(guān)性研究[D];石河子大學(xué);2015年

7 姬云翔;磷酸化Cx43蛋白在人膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)及其與腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)性研究[D];石河子大學(xué);2015年

8 朱峰;OPN的異常表達(dá)與膠質(zhì)瘤的相關(guān)性研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

9 劉兵;SENP1表達(dá)水平對(duì)人腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制及其相關(guān)性[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

10 李文華;Slit2/Robo1在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及臨床意義[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

，

本文編號(hào)：2520955