【摘要】：背景：神經膠質瘤(以下簡稱膠質瘤)是起源于神經外胚層的最常見的顱內惡性腫瘤,約占顱內腫瘤總數的一半。膠質瘤具有手術難以完全切除、放化療效果不明顯、易復發(fā)及預后差的特點。MicroRNA (miRNA)是一類通過轉錄后抑制靶基因表達的非編碼小分子RNA。越來越多的研究表明,miRNA廣泛調控了惡性腫瘤的多種生物學特性。然而,miRNA在膠質瘤發(fā)生發(fā)展中的作用研究甚少。因此,研究miRNA在膠質瘤中的作用和機制對于進一步闡釋膠質瘤的發(fā)病機制以及對于膠質瘤的診斷和治療具有重要的臨床意義。目的：本研究的主要目的是篩選在膠質瘤中具有差異性表達的miRNA;找到幾個可能調控膠質瘤生物學特性及抗藥性的miRNA;通過生物信息學軟件尋找其作用的靶基因并進行相關分子機制研究。方法：(1)根據已報道文獻中的miRNA芯片結果,首先找出與正常對照組相比在膠質瘤中表達下調的多種miRNA。然后通過MTT實驗篩選能抑制膠質瘤細胞系U87和U251細胞活性的miRNA。通過生物信息學軟件miRanda和DIANA microT v3.0進一步尋找篩選后的miRNA可能的調控靶基因。(2)收集武漢大學人民醫(yī)院2011至2014年手術切除的16例IV級膠質瘤標本。對照來源于8例腦外傷病人所切除的腦組織。然后通過qPCR檢測對照腦組織、膠質瘤組織以及U87和U251細胞系中miR-129和miR-873的表達水平。(3)在人膠質瘤細胞系U87和U251中過表達miR-129后,通過MTT法檢測細胞增殖；通過流式細胞術檢測細胞凋亡；通過qPCR、Western blot、共聚焦、透射電鏡以及裸鼠荷瘤實驗檢測miR-129對U87和U251自噬水平的影響。(4)通過luciferase實驗、qPCR和Western blot實驗驗證miR-129對Notch-1的靶向調控作用。通過qPCR和Western blot檢測miR-129對mTOR磷酸化以及E2F7和Beclin-1表達的影響。通過Western blot檢測Notch-1對E2F7和Beclin-1表達的影響以及E2F7對Beclin-1表達的影響。(5)構建U87和U251的順鉑耐藥株,分別命名為U87/DDP和U251/DDP。通過qPCR找出在順鉑耐藥株和野生株中具有表達差異的miRNA。通過MTT法檢測miR-873對順鉑耐藥株細胞增殖的影響。通過MTT法和平板克隆形成實驗檢測在順鉑作用下miR-873對細胞活性和細胞增殖的影響；并通過流式細胞術和caspase-3/7活性檢測實驗檢測在順鉑作用下miR-873對細胞凋亡的影響。(6)通過luciferase實驗、qPCR和Western blot實驗驗證miR-873對Bcl-2的靶向調控作用。通過MTT、平板克隆形成實驗、流式細胞術和qPCR和caspase-3/7活性檢測實驗檢測Bcl-2在miR-873致膠質瘤細胞順鉑增敏中的介導作用。結果：(1)從多篇已報道文獻miRNA芯片結果中找出8個在膠質瘤中表達下調的miRNA,它們分別是miR-128、miR-129、miR-133a、miR-13、miR-153、miR-323、 miR-488和miR-873。MTT實驗結果表明miR-129和miR-873能明顯抑制U87和U251的細胞活性。通過生物信息學軟件miRanda和DIANA microT v3.0預測到miR-129可能調控Notch-1和Bcl-2等多種腫瘤相關基因的表達；并且預測到miR-873可能靶向調控Bcl-2等多種腫瘤相關基因的表達。(2) qPCR檢測結果顯示：與對照腦組織相比,miR-129和miR-873在膠質瘤組織及細胞系中的表達水平顯著降低。(3)過表達miR-129不但抑制U87和U251細胞的增殖和促進其凋亡,還提高了細胞的自噬水平。抑制內源性miR-129的活性可以有效抑制雷帕霉素誘導的細胞自噬水平。裸鼠荷瘤實驗結果也表明,注射Lv-miR-129組的裸鼠較注射Lv-NC或PBS組的裸鼠腫瘤體積變小,且腫瘤組織中LC3和Beclin-1水平明顯增加。(4) Luciferase實驗、qPCR和Western blot實驗證實miR-129可以靶向調控Notch-1的表達。另外,miR-129可以通過Notch-1/mTOR或Notch-1/E2F7/Beclin-1兩種途徑影響膠質瘤細胞的自噬水平。(5)miR-873在U87/DDP和U251/DDP細胞中表達明顯下調。過表達miR-873可以抑制U87/DDP和U251/DDP細胞的增殖并且促進其凋亡。在順鉑作用下,miR-873可以增加順鉑對U87/DDP和U251/DDP細胞的殺傷作用。(6)Luciferase實驗、qPCR和Western blot實驗證實miR-873可以靶向調控Bcl-2的表達。另外,miR-873通過靶向調控Bcl-2增加順鉑對膠質瘤耐藥株的殺傷作用。結論：本研究發(fā)現,miR-129和miR-873在膠質瘤組織和細胞中表達降低,過表達miR-129或miR-873不但能抑制膠質瘤細胞的增殖還促進其凋亡。另外,miR-129可以通過Notch-1/mTOR或Notch-1/E2F7/Beclin-1兩種途徑促進膠質瘤細胞的自噬水平。miR-873通過靶向調控Bcl-2增加順鉑對膠質瘤耐藥株的殺傷作用。
【圖文】：

本作為實驗組和８例腦外傷病人所切除的腦組織作為對照組。通過ｑＰＣ民檢測逡逑ｍｉＲ－１２９和ｍｉ艮－８巧在膠質瘤和對照腦組織中的表達水平。結果表明，ｍｉＲ－１２９逡逑和ｍｉＲ－８７３在膠質瘤中的表達顯著降低（見圖１－２和圖１－３）。逡逑１４逡逑

再將收集的上清液和５邋ｕｇ／ｍｌ的ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ邋—同加入到Ｕ８７或Ｕ２５１細胞中。逡逑４８小時后分別通過巧光顯微鏡和流式檢測其感染效率。巧光顯微鏡下觀察絕大逡逑部分細胞都發(fā)綠光，且流式分析結果提巧感染效率達到９０％Ｗ上（見圖２－１邋Ａ和逡逑Ｃ）。接下來用ｑＰＣＲ檢測在Ｕ８７和Ｕ２５１中感染Ｌｖ－ＮＣ和Ｌｖ－ｍｉＲ－１２９后ｍｉＲ－１２９逡逑的表達效率。通過對比發(fā)現，在感染Ｌｖ－ｍｉＲ－１２９的４８小時后，ｍｉＲ－１２９在兩種逡逑細胞系中的表達水平均提高１０００－１５００倍（化圖２－１邋Ｂ）。在Ｕ８７細胞中分別轉染逡逑ＳＣＲ邋ｓｐｏｎｇｅ和１２９邋ｓｐｏｎｇｅ，邋４８小時后進行（ｉＰＣＲ檢測。結果提示，１巧ｓｐｏｎｇｅ逡逑可Ｗ明顯抑制ｍｉＲ－１２９的表達，證明１巧ｓｐｏｎｇｅ質粒構建成功（見圖２－１邋Ｄ）。逡逑NB邐Ｂ逡逑ＧＦＰ邐Ｆｌｏｃｈｅｓｔ邐Ｍｅｒｇｅ邐｜邐Ｓ：心邋１，，逡逑Ｉ邋ｉｒｌ－ｄｉ逡逑Ｃ邐Ｄ。逡逑心邐ＷＴ邐ＮＣ邐ｍｉＲ－１２９邐｜逡逑ｔＥ迎碰逡逑邐Ｉ：邐ｒ邐Ｉ邐／邋／逡逑ＦＩＴＣ邐爭奪４逡逑圖２－１在膠質瘤細胞中過表達和拆制ｍ化－１巧的效率。（Ａ）巧光顯微鏡觀察感染Ｌｖ－ＮＣ和逡逑Ｌｖ－ｍｉＲ－１２９的４８小時后的感染效率．（Ｂ）邋ｑＰＣＲ檢測感染Ｌｖ－ＮＣ和Ｌｖ－ｍ化－１２９的４８小逡逑時后ｍｉＲ－１２９的表達效率，＊＊Ｐ邋＜邋０．０１。（邋Ｃ邋）流式分析感染Ｌｖ－ＮＣ和Ｌｖ－ｍＵｌ－ｌ巧的４８小逡逑４６逡逑
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R739.41

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本文編號：2520955