【摘要】：Cripto-1是EGF-CFC家族的成員,在腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。但目前為止,有關(guān)Cripto-1對免疫功能的影響尚不清楚。本文擬從巨噬細胞角度探討原癌基因Cripto-1對免疫功能的影響及其機制。為了探討Cripto-1對巨噬細胞功能的影響,我們建立了一個穩(wěn)定表達Cripto-1的L02細胞系,并用穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞的上清液對巨噬細胞進行處理,之后通過實時定量PCR和Western blot方法檢測巨噬細胞產(chǎn)生細胞因子的情況。結(jié)果顯示,實驗組的巨噬細胞中炎癥因子IL-1β、TNF-α和IL-6以及抗炎癥因子IL-10的表達顯著上調(diào),而抗炎癥因子TGF-β的表達并沒有發(fā)生明顯的變化。因為穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞上清中除了含有Cripto-1蛋白外,還含有其它分泌蛋白,為了確定細胞上清對巨噬細胞分泌功能的影響是否是由Cripto-1引起的,我們用原核表達純化的Cripto-1蛋白處理巨噬細胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),Ctipto-1蛋白對巨噬細胞功能的影響與細胞上清具有相同的趨勢。這些結(jié)果表明,Cripto-1可能通過上調(diào)巨噬細胞中某些炎癥因子和抗炎癥因子的表達,進而對機體的免疫功能產(chǎn)生影響。之后我們研究了Cripto-1對巨噬細胞吞噬功能的影響。我們選取小鼠原代巨噬細胞以及人的巨噬細胞進行實驗,利用穩(wěn)轉(zhuǎn)Cripto-1的細胞上清液或者純化的Cripto-1蛋白處理巨噬細胞,之后通過雞紅細胞吞噬實驗檢測巨噬細胞的吞噬功能。結(jié)果顯示,實驗組的巨噬細胞吞噬能力較對照組有明顯提高。以上結(jié)果表明,Cripto-1對巨噬細胞的分泌功能和吞噬功能均具有一定的調(diào)節(jié)作用。我們進一步分析了Cripto-1調(diào)節(jié)巨噬細胞免疫功能的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。我們利用純化的Cripto-1蛋白處理巨噬細胞,20分鐘后檢測NF-κB信號的活化情況。結(jié)果顯示,Cripto-1處理后,巨噬細胞中的p-IKK水平顯著提高,并且p65的入核也顯著增加。也就是說,Cripto-1激活了巨噬細胞中的NF-κB信號通路。為了闡明Cripto-1是否是通過NF-κB信號通路來調(diào)控巨噬細胞功能的,我們又利用NF-κB信號通路的抑制劑PDTC去抑制細胞內(nèi)的NF-κB信號,之后檢測巨噬細胞的功能。結(jié)果顯示,Cripto-1誘導(dǎo)的巨噬細胞分泌功能和吞噬功能被明顯抑制。以上結(jié)果提示,Cripto-1可通過激活NF-κB信號途徑增強巨噬細胞的吞噬功能,并促進部分炎癥因子及抗炎癥因子的表達。Skp2(S-phase kinase associated protein 2)屬于F-box蛋白家族成員,在多種腫瘤細胞中高表達,對腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要的作用。本實驗室前期的研究發(fā)現(xiàn),293T細胞中轉(zhuǎn)染Cripto-1的真核表達載體后,細胞中Skp2的mRNA和蛋白的表達明顯被抑制。而且我們通過報告基因法和免疫印跡法證明在293T細胞中,Cripto-1的過表達明顯抑制了p38/MAPK信號通路。暗示Cripto-1調(diào)控Skp2的表達是通過p38/MAPK信號通路來實現(xiàn)的。那么為了證明這一結(jié)果,我們將p38的失活突變體DN-p38轉(zhuǎn)入293T細胞內(nèi)以抑制p38/MAPK信號。結(jié)果顯示,當p38/MAPK信號被抑制以后,Skp2的表達量明顯下降。這些實驗結(jié)果說明,Cripto-1可通過p38/MAPK信號通路調(diào)控Skp2的表達。為了進一步驗證以上結(jié)論,我們利用靶向Cripto-1的siRNA對Huh7細胞進行處理。結(jié)果顯示,當Cripto-1表達下調(diào)時,p38被激活,Skp2的表達上升。但是當共轉(zhuǎn)染p38的失活突變體DN-p38后,這一實驗結(jié)果被逆轉(zhuǎn),即下調(diào)了p-p38的表達,Skp2的表達量也隨之降低。以上研究結(jié)果提示,Cripto-1通過抑制p38/MAPK信號通路調(diào)控Skp2的表達。本研究證實了原癌基因Cripto-1參與了機體免疫系統(tǒng)中巨噬細胞功能的調(diào)控,這為我們研究癌基因與機體免疫功能之間的關(guān)系奠定了一定的實驗基礎(chǔ)。并且Cripto-1還可通過p38/MAPK信號通路調(diào)控原癌基因Skp2的表達。這一研究結(jié)果為人們開發(fā)以Skp2為靶點的抗癌藥物提供了重要的理論依據(jù)。
【圖文】：

二）原癌基因 Skp2 的結(jié)構(gòu)癌基因 Skp2 定位于常染色體 5p13，其基因全長大約為 31962b2 編碼的產(chǎn)物由 436 個氨基酸組成[115]。kp2 包括一個 F-box 結(jié)構(gòu)域、十個富含亮氨酸的重復(fù)區(qū)域和 Lin中 Fox 結(jié)構(gòu)域的作用是可以與 Skp1 相結(jié)合，富含亮氨酸的重復(fù)物識別的區(qū)域[115]。三）原癌基因 Skp2 的生物學(xué)功能kp2 可以與 Skp1 和 Cull 共同組成 SCF 復(fù)合物，SCF 復(fù)合物又稱合物，，其作為一個 E3 連接酶，在泛素-蛋白酶體降解途徑中發(fā)揮

Cripto-1 是表皮生長因子 EGF-CFC 家族成員，已經(jīng)證過程中發(fā)揮重要作用。本研究主要從巨噬細胞角度探功能的影響，以及 Cripto-1 發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能的機制原癌基因 Cripto-1 對巨噬細胞功能的影響，我們首先構(gòu)L02 細胞系。我們將 Cripto-1 的真核表達載體（pCI-n胞，經(jīng)過 G418（濃度為 400 600 μg/mL）的反復(fù)篩選上清，并提取細胞質(zhì)蛋白，利用 Western blot 方法檢測 Cripto-1 蛋白。如圖2所示，穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞的胞質(zhì)蛋白中檢測到了Cripto-1則無表達。并且我們也在收集的細胞上清液中檢測到了顯示，我們構(gòu)建的這個穩(wěn)定表達 Cripto-1 的 L02 細胞系的實驗研究。之后，我們將利用這一細胞系，研究 Cri控作用。
【學(xué)位授予單位】：東北師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R730.2

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本文編號：2520732