【摘要】：背景:乳腺癌的多藥耐藥性(Multidrug Resistance,MDR)是導致化療失敗及復發(fā)的最主要原因。腫瘤細胞可隨誘導藥物、誘導方式、細胞分化階段及所處微環(huán)境的不同而表現(xiàn)出不同的耐藥表型。MDR是指腫瘤對一種化療藥物出現(xiàn)耐藥的同時對其他結(jié)構(gòu)和功能各異的藥物亦產(chǎn)生交叉耐藥現(xiàn)象。難以避免的化療耐藥一直是有效控制乳腺癌的關鍵瓶頸。因此深入的研究乳腺癌的耐藥機制,尋找新的耐藥相關生物學標志物對于有效逆轉(zhuǎn)化療耐藥,提高乳腺癌的整體治療水平具有非常重要的理論意義,并且為其臨床應用開展提供前期基礎。micro RNA(mi RNA)是由長18~24個核苷酸組成的、內(nèi)源性高度保守的非編碼單鏈RNA,mi RNA發(fā)揮作用的機制是通過與靶基因的m RNA結(jié)合進而降解或者抑制其翻譯,不同的mi RNA可以靶向調(diào)控同一靶基因,而一個mi RNA在不同情況下可以調(diào)控下游不同的靶基因,其基因表達調(diào)控方式為我們更加全面地了解腫瘤的發(fā)生發(fā)展,包括腫瘤細胞的MDR均開拓了更多的思路,對進一步認識和理解腫瘤耐藥發(fā)生的潛在的分子機制均具有重要意義。在本文的工作中,我們主要對乳腺癌多藥耐藥相關mi RNA:mi R-205在乳腺癌耐藥過程中發(fā)揮的功能,明確與mi R-205直接結(jié)合并受其調(diào)控的靶基因,及是否通過該靶基因影響乳腺癌的耐藥及相關分子機制進行了研究與探討。方法:1.使用mi RNA芯片對敏感株乳腺癌細胞MCF-7與耐藥株乳腺癌細胞MCF-7/A02中的人源mi RNA表達譜進行檢測,篩選出在兩種細胞系中表達差異最顯著的mi RNA:mi R-205作為后續(xù)實驗研究的對象。2.用Taqman實時定量PCR的方法在不同乳腺癌細胞及對應耐藥細胞株中驗證mi R-205表達與腫瘤細胞耐藥的相關性,并在其他耐藥細胞系進一步驗證。并且檢測新輔助化療前乳腺癌組織中mi R-205表達的情況,了解mi R-205的表達與乳腺癌新輔助化療敏感性的關系。3.在MCF-7/A02細胞和CALDOX細胞中用慢病毒感染方式過表達mi R-205,以MTT方法檢測細胞對阿霉素(DOX)、紫杉醇(Taxol)、依托泊苷(VP-16)的IC50,檢測其耐藥性的變化;采用平板克隆形成實驗方法,評價腫瘤細胞對阿霉素、紫杉醇的敏感性;通過Annexin V/PI染色法,Caspase-3/7活性檢測以及Caspase-9檢測法等方法檢測紫杉醇對目標細胞的凋亡誘導作用,同時使用實時定量PCR法檢測凋亡相關基因的m RNA水平改變,采用Western-blotting檢測了PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路活性及相關凋亡蛋白的改變。4.綜合生物信息學預測軟件得到mi R-205的候選基因VEGFA和FGF2。實時定量PCR方法檢測FGF2與VEGFA在MCF-7 VS MCF-7/A02細胞和CAL51VS CALDOX細胞系中的表達差異,同時ELISA法檢測四組細胞上清液中VEGFA和FGF2兩種因子的變化情況。進一步檢測MCF-7/A02和CALDOX兩組耐藥細胞系轉(zhuǎn)染mi R-205后,細胞VEGFA和FGF2基因的變化及上清液中兩種因子的變達改變,分析比較各細胞系中mi R-205表達、VEGFA和FGF2基礎表達水平的相關性。雙熒光素酶報告實驗驗證mi R-205和VEGFA 3'UTR和FGF23'UTR的靶向關系。5.檢測新輔助化療前乳腺癌組織中VEGFA和FGF2表達情況,分析其表達水平與乳腺癌新輔助化療敏感性及mi R-205的相關性。以MTT方法檢測過表達VEGFA和FGF2和沉默兩者后細胞對阿霉素、紫杉醇、依托泊苷的IC50,檢測其藥物敏感性的變化;并進一步檢測VEGFA和FGF2對細胞凋亡的影響。6.采用rescue實驗檢測VEGFA和FGF2的過表達是否可以逆轉(zhuǎn)mi R-205對乳腺癌化療耐藥性抑制,以確認VEGFA和FGF2作為mi R-205下游功能性的直接靶點調(diào)控乳腺癌化療耐藥性:以MTT方法檢測處理后各組細胞對阿霉素、紫杉醇、依托泊苷的IC50,檢測其耐藥性的變化;采用平板克隆形成實驗方法,評價各組細胞對阿霉素、紫杉醇的敏感性;通過Annexin V/PI染色法,Caspase-3/7活性檢測以及Caspase-9檢測法等方法檢測紫杉醇對各組細胞的凋亡誘導作用,同時檢測凋亡相關蛋白及PI3K/AKT信號通路蛋白的變化,以確認mi R-205與VEGFA和FGF2的相互作用對下游通路的影響。7.采用上述方法檢測在MCF-7/A02和CALDOX耐藥細胞系應用PI3K抑制劑后對凋亡的影響,以進一步證明mi R-205對MCF-7/A02與CALDOX細胞化療敏感性的調(diào)控作用是通過影響PI3K/AKT通路活性完成的。8.建立裸鼠皮下移植瘤模型。將BALB/c裸鼠隨機分為四組,將MCF-7/A02-mi R-205、MCF-7/A02-NC、CALDOX-mi R-205和CALDOX-NC細胞的細胞懸液分別接種于各組裸鼠右腋皮下,約1周后,開始每隔3天清晨用游標卡尺測量小鼠移植瘤最長徑L和最短徑W,計算腫瘤體積并做好記錄。于d15最后一次測量腫瘤體積后,給藥DOX(1mg/kg)Taxol(2.5mg/kg)每三天1次腹腔注射。開始每隔3天測量小鼠移植瘤,計算腫瘤體積,于d45最后一次測量腫瘤體積,統(tǒng)一頸椎脫臼處死,剝離瘤塊,稱重,液氮保存?zhèn)溆�。分別取各組瘤組織,實時定量PCR檢測MCF-7/A02-mi R-205及空白對照細胞移植瘤體中mi R-205的表達及VEGFA、FGF2、bax和survivin的表達變化情況。ELISA法檢測動物模型血液中VEGFA和FGF2的表達變化。結(jié)果:1.對比MCF-7細胞與MCF-7/A02細胞中mi RNA芯片表達譜結(jié)果,在這兩種細胞內(nèi)共獲得19個差異表達的mi RNA,結(jié)合本課題組前期血清學mi RNA檢測結(jié)果,選定在耐藥細胞系中為下調(diào)表達的mi R-205為進一步的研究對象。2.采用q PCR方法對芯片結(jié)果進行驗證后發(fā)現(xiàn)在乳腺癌MCF-7細胞、Cal51細胞、MTMEC細胞及其對應耐藥細胞系中,mi R-205在耐藥細胞中低表達,同時在白血病K562細胞、HL60細胞、淋巴瘤BJAB細胞及對應耐藥細胞中mi R-205表達量與耐藥性呈負相關性。mi R-205表達量與乳腺癌患者新輔助化療療效正相關,即mi R-205表達越高療效越好。3.在乳腺癌耐藥細胞MCF-7/A02和CALDOX細胞中過表達mi R-205后腫瘤細胞對阿霉素的敏感性提高,同時對紫杉醇、依托泊苷的化療敏感性均有所提高;平板克隆形成實驗檢測發(fā)現(xiàn),相同化療藥物濃度下,mi R-205過表達能抑制MCF-7/A02和CALDOX細胞的克隆形成能力;對于由紫杉醇誘導的細胞凋亡檢測實驗,過表達mi R-205后乳腺癌細胞凋亡程度顯著提高;過表達mi R-205后,各組細胞凋亡基因Bax m RNA表達增加,抗凋亡基因survivin m RNA表達下降;在蛋白水平的檢測中,p AKT表達下降,促凋亡蛋白Bax表達增加,抗凋亡蛋白survivin表達下降。4.生物信息學軟件預測顯示VEGFA和FGF2 m RNA 3'UTR和mi R-205有兩處可以結(jié)合的保守序列。VEGFA和FGF2在兩種耐藥細胞系中表達均高于在對照細胞中的表達,在細胞上清液中的兩種因子的表達也明顯升高。且在mi R-205過表達的乳腺癌細胞系中,mi R-205不僅可以在m RNA水平并且也可以在細胞因子水平抑制VEGFA和FGF2的表達。雙熒光素酶報告實驗中,mi R-205可以降低構(gòu)建的VEGFA 3'UTR和FGF2 3'UTR野生載體的熒光活性。5.分析新輔助化療前患者乳腺癌組織中mi R-205和VEGFA和FGF2表達,發(fā)現(xiàn)三者呈負相關,并且mi R-205含量越高,患者新輔助化療療效越好,而高表達VEGFA和FGF2的患者其新輔助化療療效較差。在MCF-7和CAL 51細胞中加入VEGFA和FGF2因子后,直接導致細胞對阿霉素的耐藥,凋亡減少,Bax的m RNA和蛋白表達均下降,而survivin m RNA和蛋白表達增多,激活PI3K/AKT通路;而外源轉(zhuǎn)入VEGFAsi RNA和FGF2 si RNA的CALDOX細胞,對阿霉素的敏感性提高。6.Rescue實驗結(jié)果顯示,在mi R-205穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞中轉(zhuǎn)入VEGFA和FGF2后,降低耐藥細胞的化療敏感性,凋亡減少。VEGFA和FGF2過表達后,逆轉(zhuǎn)mi R-205促進紫杉醇誘導的細胞凋亡,并且可減弱mi R-205對PI3K/AKT通路的削弱作用。Bax的m RNA和蛋白表達均下降,而survivin m RNA和蛋白表達增多。7.MCF-7/A02細胞給予10μM,CALDOX細胞給予2μM PI3K抑制劑LY294002處理24小時,同時添加不同濃度的紫杉醇(0.25μM VS 2.5 n M)處理48小時后,Bax的m RNA和蛋白表達均增加,而survivin m RNA和蛋白表達減少。也間接提示mi R-205是通過抑制PI3K/AKT通路活性來誘導凋亡而增加乳腺癌細胞化療敏感性的。8.通過裸鼠皮下移植瘤模型證明過表達mi R-205能顯著抑制MCF-7/A02接種后小鼠腫瘤體積的生長,同時能夠提高裸鼠接受紫杉聯(lián)合蒽環(huán)類化療的敏感性。腫瘤組織中VEGFA、FGF2和survivin表達減少,bax表達增多。小鼠外周血清中VEGFA和FGF2兩種因子表達下降。而CALDOX-mi R-205細胞接種后的小鼠未見明顯成瘤。結(jié)論:mi R-205在乳腺癌細胞及其他多種腫瘤細胞中與多藥耐藥性呈負相關。mi R-205表達量與乳腺癌患者新輔助化療療效正相關,其表達越高療效越好。在乳腺癌細胞中過表達mi R-205后,腫瘤細胞對阿霉素的敏感性提高,同時對紫杉醇、依托泊苷的化療敏感性均有所提高;并能促進紫杉醇誘導的細胞凋亡。并且mi R-205是直接通過靶向VEGFA和FGF2實現(xiàn)削弱PI3K/AKT通路活性,減少p AKT表達,增加促凋亡蛋白Bax,減少抗凋亡蛋白survivin表達進而實現(xiàn)其促進凋亡影響乳腺癌細胞多藥耐藥的功能。過表達mi R-205能明顯抑制裸鼠移植瘤的生長,并且可以通過抑制VEGFA和FGF2提高腫瘤的化療敏感性。以mi R-205為治療靶點逆轉(zhuǎn)乳腺癌的耐藥,將為乳腺癌的治療帶來新的探索。
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圖片說明： .1：MCF-7（S1、S3、S4）與 MCF-7/A02（R1、R2、R3）細胞中差異表達的 micr表達譜對耐藥細胞系及對應親本細胞系差異表達的 19 個 microRNAs 中，前期研究中發(fā)現(xiàn) miR-205 在癌組織中是下調(diào)的，并且可以促進 MCF亡[21]，所以我們選擇 miR-205 作為后續(xù)研究的主要對象。Taqman 實時定量 PCR 法驗證 microRNA 芯片結(jié)果到了 microRNA 芯片結(jié)果后，我們在乳腺癌 MCF-7 細胞與 Cal51 細-205 的表達量用 Taqman 實時定量 PCR 的方法進行了驗證。結(jié)果5 的表達量隨細胞耐藥程度的增加而減低，差異有統(tǒng)計學意義（P<02-A,B）。除了 MCF-7 細胞、Cal51 乳腺癌細胞當中，miR-205 表達量性的關系在人乳腺癌 MTMEC 細胞、白血病 K562 細胞、HL60 細胞JAB 細胞中也得到了驗證（圖 1.2-C），即這些耐藥細胞系中 miR-2均不同程度地低于其相對的敏感細胞系，，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.
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圖片說明： 圖 1.3：miR-205 表達量與乳腺癌患者新輔助化療療效相關性分析1.2.4 miR-205 慢病毒侵染與穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的建立表達 miR-205 的慢病毒和對照慢病毒均從蘇州吉瑪基因公司購買，分別命名為“LV2（U6/Puro）-hsa-miR-205-5p”和“LV1-NC”（圖 1.4.1 和 1.4.2 測序結(jié)果）。LV1-NC 序列（5’ to 3’）：TTCTCCGAACGTGTCACGTTTC圖 1.4.1 LV1-NC 測序結(jié)果LV2（U6/Puro）-hsa-miR-205-5p（5’ to 3’）：TCCTTCATTCCACCGGAGTCTG圖 1.4.2 LV2（U6/Puro）-hsa-miR-205-5p 測序結(jié)果在得到了 LV2（U6/Puro）-hsa-miR-205-5p 慢病毒真核表達載體后，我們用慢病毒感染的方法使 MCF-7/A02 和 CALDOX 細胞過表達 miR-205，感染 96h
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9

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本文編號：2515731