【摘要】：背景:乳腺癌的多藥耐藥性(Multidrug Resistance,MDR)是導(dǎo)致化療失敗及復(fù)發(fā)的最主要原因。腫瘤細(xì)胞可隨誘導(dǎo)藥物、誘導(dǎo)方式、細(xì)胞分化階段及所處微環(huán)境的不同而表現(xiàn)出不同的耐藥表型。MDR是指腫瘤對一種化療藥物出現(xiàn)耐藥的同時對其他結(jié)構(gòu)和功能各異的藥物亦產(chǎn)生交叉耐藥現(xiàn)象。難以避免的化療耐藥一直是有效控制乳腺癌的關(guān)鍵瓶頸。因此深入的研究乳腺癌的耐藥機(jī)制,尋找新的耐藥相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物對于有效逆轉(zhuǎn)化療耐藥,提高乳腺癌的整體治療水平具有非常重要的理論意義,并且為其臨床應(yīng)用開展提供前期基礎(chǔ)。micro RNA(mi RNA)是由長18~24個核苷酸組成的、內(nèi)源性高度保守的非編碼單鏈RNA,mi RNA發(fā)揮作用的機(jī)制是通過與靶基因的m RNA結(jié)合進(jìn)而降解或者抑制其翻譯,不同的mi RNA可以靶向調(diào)控同一靶基因,而一個mi RNA在不同情況下可以調(diào)控下游不同的靶基因,其基因表達(dá)調(diào)控方式為我們更加全面地了解腫瘤的發(fā)生發(fā)展,包括腫瘤細(xì)胞的MDR均開拓了更多的思路,對進(jìn)一步認(rèn)識和理解腫瘤耐藥發(fā)生的潛在的分子機(jī)制均具有重要意義。在本文的工作中,我們主要對乳腺癌多藥耐藥相關(guān)mi RNA:mi R-205在乳腺癌耐藥過程中發(fā)揮的功能,明確與mi R-205直接結(jié)合并受其調(diào)控的靶基因,及是否通過該靶基因影響乳腺癌的耐藥及相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)行了研究與探討。方法:1.使用mi RNA芯片對敏感株乳腺癌細(xì)胞MCF-7與耐藥株乳腺癌細(xì)胞MCF-7/A02中的人源mi RNA表達(dá)譜進(jìn)行檢測,篩選出在兩種細(xì)胞系中表達(dá)差異最顯著的mi RNA:mi R-205作為后續(xù)實驗研究的對象。2.用Taqman實時定量PCR的方法在不同乳腺癌細(xì)胞及對應(yīng)耐藥細(xì)胞株中驗證mi R-205表達(dá)與腫瘤細(xì)胞耐藥的相關(guān)性,并在其他耐藥細(xì)胞系進(jìn)一步驗證。并且檢測新輔助化療前乳腺癌組織中mi R-205表達(dá)的情況,了解mi R-205的表達(dá)與乳腺癌新輔助化療敏感性的關(guān)系。3.在MCF-7/A02細(xì)胞和CALDOX細(xì)胞中用慢病毒感染方式過表達(dá)mi R-205,以MTT方法檢測細(xì)胞對阿霉素(DOX)、紫杉醇(Taxol)、依托泊苷(VP-16)的IC50,檢測其耐藥性的變化;采用平板克隆形成實驗方法,評價腫瘤細(xì)胞對阿霉素、紫杉醇的敏感性;通過Annexin V/PI染色法,Caspase-3/7活性檢測以及Caspase-9檢測法等方法檢測紫杉醇對目標(biāo)細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用,同時使用實時定量PCR法檢測凋亡相關(guān)基因的m RNA水平改變,采用Western-blotting檢測了PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性及相關(guān)凋亡蛋白的改變。4.綜合生物信息學(xué)預(yù)測軟件得到mi R-205的候選基因VEGFA和FGF2。實時定量PCR方法檢測FGF2與VEGFA在MCF-7 VS MCF-7/A02細(xì)胞和CAL51VS CALDOX細(xì)胞系中的表達(dá)差異,同時ELISA法檢測四組細(xì)胞上清液中VEGFA和FGF2兩種因子的變化情況。進(jìn)一步檢測MCF-7/A02和CALDOX兩組耐藥細(xì)胞系轉(zhuǎn)染mi R-205后,細(xì)胞VEGFA和FGF2基因的變化及上清液中兩種因子的變達(dá)改變,分析比較各細(xì)胞系中mi R-205表達(dá)、VEGFA和FGF2基礎(chǔ)表達(dá)水平的相關(guān)性。雙熒光素酶報告實驗驗證mi R-205和VEGFA 3'UTR和FGF23'UTR的靶向關(guān)系。5.檢測新輔助化療前乳腺癌組織中VEGFA和FGF2表達(dá)情況,分析其表達(dá)水平與乳腺癌新輔助化療敏感性及mi R-205的相關(guān)性。以MTT方法檢測過表達(dá)VEGFA和FGF2和沉默兩者后細(xì)胞對阿霉素、紫杉醇、依托泊苷的IC50,檢測其藥物敏感性的變化;并進(jìn)一步檢測VEGFA和FGF2對細(xì)胞凋亡的影響。6.采用rescue實驗檢測VEGFA和FGF2的過表達(dá)是否可以逆轉(zhuǎn)mi R-205對乳腺癌化療耐藥性抑制,以確認(rèn)VEGFA和FGF2作為mi R-205下游功能性的直接靶點調(diào)控乳腺癌化療耐藥性:以MTT方法檢測處理后各組細(xì)胞對阿霉素、紫杉醇、依托泊苷的IC50,檢測其耐藥性的變化;采用平板克隆形成實驗方法,評價各組細(xì)胞對阿霉素、紫杉醇的敏感性;通過Annexin V/PI染色法,Caspase-3/7活性檢測以及Caspase-9檢測法等方法檢測紫杉醇對各組細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用,同時檢測凋亡相關(guān)蛋白及PI3K/AKT信號通路蛋白的變化,以確認(rèn)mi R-205與VEGFA和FGF2的相互作用對下游通路的影響。7.采用上述方法檢測在MCF-7/A02和CALDOX耐藥細(xì)胞系應(yīng)用PI3K抑制劑后對凋亡的影響,以進(jìn)一步證明mi R-205對MCF-7/A02與CALDOX細(xì)胞化療敏感性的調(diào)控作用是通過影響PI3K/AKT通路活性完成的。8.建立裸鼠皮下移植瘤模型。將BALB/c裸鼠隨機(jī)分為四組,將MCF-7/A02-mi R-205、MCF-7/A02-NC、CALDOX-mi R-205和CALDOX-NC細(xì)胞的細(xì)胞懸液分別接種于各組裸鼠右腋皮下,約1周后,開始每隔3天清晨用游標(biāo)卡尺測量小鼠移植瘤最長徑L和最短徑W,計算腫瘤體積并做好記錄。于d15最后一次測量腫瘤體積后,給藥DOX(1mg/kg)Taxol(2.5mg/kg)每三天1次腹腔注射。開始每隔3天測量小鼠移植瘤,計算腫瘤體積,于d45最后一次測量腫瘤體積,統(tǒng)一頸椎脫臼處死,剝離瘤塊,稱重,液氮保存?zhèn)溆�。分別取各組瘤組織,實時定量PCR檢測MCF-7/A02-mi R-205及空白對照細(xì)胞移植瘤體中mi R-205的表達(dá)及VEGFA、FGF2、bax和survivin的表達(dá)變化情況。ELISA法檢測動物模型血液中VEGFA和FGF2的表達(dá)變化。結(jié)果:1.對比MCF-7細(xì)胞與MCF-7/A02細(xì)胞中mi RNA芯片表達(dá)譜結(jié)果,在這兩種細(xì)胞內(nèi)共獲得19個差異表達(dá)的mi RNA,結(jié)合本課題組前期血清學(xué)mi RNA檢測結(jié)果,選定在耐藥細(xì)胞系中為下調(diào)表達(dá)的mi R-205為進(jìn)一步的研究對象。2.采用q PCR方法對芯片結(jié)果進(jìn)行驗證后發(fā)現(xiàn)在乳腺癌MCF-7細(xì)胞、Cal51細(xì)胞、MTMEC細(xì)胞及其對應(yīng)耐藥細(xì)胞系中,mi R-205在耐藥細(xì)胞中低表達(dá),同時在白血病K562細(xì)胞、HL60細(xì)胞、淋巴瘤BJAB細(xì)胞及對應(yīng)耐藥細(xì)胞中mi R-205表達(dá)量與耐藥性呈負(fù)相關(guān)性。mi R-205表達(dá)量與乳腺癌患者新輔助化療療效正相關(guān),即mi R-205表達(dá)越高療效越好。3.在乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/A02和CALDOX細(xì)胞中過表達(dá)mi R-205后腫瘤細(xì)胞對阿霉素的敏感性提高,同時對紫杉醇、依托泊苷的化療敏感性均有所提高;平板克隆形成實驗檢測發(fā)現(xiàn),相同化療藥物濃度下,mi R-205過表達(dá)能抑制MCF-7/A02和CALDOX細(xì)胞的克隆形成能力;對于由紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡檢測實驗,過表達(dá)mi R-205后乳腺癌細(xì)胞凋亡程度顯著提高;過表達(dá)mi R-205后,各組細(xì)胞凋亡基因Bax m RNA表達(dá)增加,抗凋亡基因survivin m RNA表達(dá)下降;在蛋白水平的檢測中,p AKT表達(dá)下降,促凋亡蛋白Bax表達(dá)增加,抗凋亡蛋白survivin表達(dá)下降。4.生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示VEGFA和FGF2 m RNA 3'UTR和mi R-205有兩處可以結(jié)合的保守序列。VEGFA和FGF2在兩種耐藥細(xì)胞系中表達(dá)均高于在對照細(xì)胞中的表達(dá),在細(xì)胞上清液中的兩種因子的表達(dá)也明顯升高。且在mi R-205過表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系中,mi R-205不僅可以在m RNA水平并且也可以在細(xì)胞因子水平抑制VEGFA和FGF2的表達(dá)。雙熒光素酶報告實驗中,mi R-205可以降低構(gòu)建的VEGFA 3'UTR和FGF2 3'UTR野生載體的熒光活性。5.分析新輔助化療前患者乳腺癌組織中mi R-205和VEGFA和FGF2表達(dá),發(fā)現(xiàn)三者呈負(fù)相關(guān),并且mi R-205含量越高,患者新輔助化療療效越好,而高表達(dá)VEGFA和FGF2的患者其新輔助化療療效較差。在MCF-7和CAL 51細(xì)胞中加入VEGFA和FGF2因子后,直接導(dǎo)致細(xì)胞對阿霉素的耐藥,凋亡減少,Bax的m RNA和蛋白表達(dá)均下降,而survivin m RNA和蛋白表達(dá)增多,激活PI3K/AKT通路;而外源轉(zhuǎn)入VEGFAsi RNA和FGF2 si RNA的CALDOX細(xì)胞,對阿霉素的敏感性提高。6.Rescue實驗結(jié)果顯示,在mi R-205穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中轉(zhuǎn)入VEGFA和FGF2后,降低耐藥細(xì)胞的化療敏感性,凋亡減少。VEGFA和FGF2過表達(dá)后,逆轉(zhuǎn)mi R-205促進(jìn)紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,并且可減弱mi R-205對PI3K/AKT通路的削弱作用。Bax的m RNA和蛋白表達(dá)均下降,而survivin m RNA和蛋白表達(dá)增多。7.MCF-7/A02細(xì)胞給予10μM,CALDOX細(xì)胞給予2μM PI3K抑制劑LY294002處理24小時,同時添加不同濃度的紫杉醇(0.25μM VS 2.5 n M)處理48小時后,Bax的m RNA和蛋白表達(dá)均增加,而survivin m RNA和蛋白表達(dá)減少。也間接提示mi R-205是通過抑制PI3K/AKT通路活性來誘導(dǎo)凋亡而增加乳腺癌細(xì)胞化療敏感性的。8.通過裸鼠皮下移植瘤模型證明過表達(dá)mi R-205能顯著抑制MCF-7/A02接種后小鼠腫瘤體積的生長,同時能夠提高裸鼠接受紫杉聯(lián)合蒽環(huán)類化療的敏感性。腫瘤組織中VEGFA、FGF2和survivin表達(dá)減少,bax表達(dá)增多。小鼠外周血清中VEGFA和FGF2兩種因子表達(dá)下降。而CALDOX-mi R-205細(xì)胞接種后的小鼠未見明顯成瘤。結(jié)論:mi R-205在乳腺癌細(xì)胞及其他多種腫瘤細(xì)胞中與多藥耐藥性呈負(fù)相關(guān)。mi R-205表達(dá)量與乳腺癌患者新輔助化療療效正相關(guān),其表達(dá)越高療效越好。在乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)mi R-205后,腫瘤細(xì)胞對阿霉素的敏感性提高,同時對紫杉醇、依托泊苷的化療敏感性均有所提高;并能促進(jìn)紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。并且mi R-205是直接通過靶向VEGFA和FGF2實現(xiàn)削弱PI3K/AKT通路活性,減少p AKT表達(dá),增加促凋亡蛋白Bax,減少抗凋亡蛋白survivin表達(dá)進(jìn)而實現(xiàn)其促進(jìn)凋亡影響乳腺癌細(xì)胞多藥耐藥的功能。過表達(dá)mi R-205能明顯抑制裸鼠移植瘤的生長,并且可以通過抑制VEGFA和FGF2提高腫瘤的化療敏感性。以mi R-205為治療靶點逆轉(zhuǎn)乳腺癌的耐藥,將為乳腺癌的治療帶來新的探索。
文內(nèi)圖片：
圖片說明： .1：MCF-7（S1、S3、S4）與 MCF-7/A02（R1、R2、R3）細(xì)胞中差異表達(dá)的 micr表達(dá)譜對耐藥細(xì)胞系及對應(yīng)親本細(xì)胞系差異表達(dá)的 19 個 microRNAs 中，前期研究中發(fā)現(xiàn) miR-205 在癌組織中是下調(diào)的，并且可以促進(jìn) MCF亡[21]，所以我們選擇 miR-205 作為后續(xù)研究的主要對象。Taqman 實時定量 PCR 法驗證 microRNA 芯片結(jié)果到了 microRNA 芯片結(jié)果后，我們在乳腺癌 MCF-7 細(xì)胞與 Cal51 細(xì)-205 的表達(dá)量用 Taqman 實時定量 PCR 的方法進(jìn)行了驗證。結(jié)果5 的表達(dá)量隨細(xì)胞耐藥程度的增加而減低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<02-A,B）。除了 MCF-7 細(xì)胞、Cal51 乳腺癌細(xì)胞當(dāng)中，miR-205 表達(dá)量性的關(guān)系在人乳腺癌 MTMEC 細(xì)胞、白血病 K562 細(xì)胞、HL60 細(xì)胞JAB 細(xì)胞中也得到了驗證（圖 1.2-C），即這些耐藥細(xì)胞系中 miR-2均不同程度地低于其相對的敏感細(xì)胞系，，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.
文內(nèi)圖片：
圖片說明： 圖 1.3：miR-205 表達(dá)量與乳腺癌患者新輔助化療療效相關(guān)性分析1.2.4 miR-205 慢病毒侵染與穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的建立表達(dá) miR-205 的慢病毒和對照慢病毒均從蘇州吉瑪基因公司購買，分別命名為“LV2（U6/Puro）-hsa-miR-205-5p”和“LV1-NC”（圖 1.4.1 和 1.4.2 測序結(jié)果）。LV1-NC 序列（5’ to 3’）：TTCTCCGAACGTGTCACGTTTC圖 1.4.1 LV1-NC 測序結(jié)果LV2（U6/Puro）-hsa-miR-205-5p（5’ to 3’）：TCCTTCATTCCACCGGAGTCTG圖 1.4.2 LV2（U6/Puro）-hsa-miR-205-5p 測序結(jié)果在得到了 LV2（U6/Puro）-hsa-miR-205-5p 慢病毒真核表達(dá)載體后，我們用慢病毒感染的方法使 MCF-7/A02 和 CALDOX 細(xì)胞過表達(dá) miR-205，感染 96h
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9
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