【摘要】：結直腸癌是一類嚴重威脅人類健康和生存的惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計,在世界范圍內(nèi),結直腸癌發(fā)病率及死亡率均居惡性腫瘤的第三位[1]。在我國,隨著居民生活方式和膳食結構的改變,以及人口老齡化進程的加快,結直腸癌的發(fā)病率多年來呈明顯上升趨勢,多集中于60-74歲的老年人[2]。盡管近年來結直腸癌的早期診斷及治療手段取得了一定的進步,但中晚期結直腸癌患者的死亡率仍居高不下,而轉(zhuǎn)移和復發(fā)是導致死亡率明顯增加的重要原因。據(jù)2016年最新癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計,發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的結直腸癌病人的五年生存率僅為13%[1]。因此,積極開展對結直腸癌轉(zhuǎn)移機制的研究,尋找新的關鍵分子和治療靶點,對結直腸癌的干預和治療具有重大意義。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial Mesenchymal Transition,EMT)主要是指上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的過程。在這個過程中,上皮細胞逐漸失去上皮表型,如極性的丟失,細胞與細胞間連接消失,上皮標志物表達下調(diào)或缺失,繼而逐漸獲得間質(zhì)細胞表型,如細胞骨架的重塑,間質(zhì)標志物的表達增加或獲得,細胞的遷移侵襲能力增強等[3,4]。目前普遍認為EMT在結直腸癌的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用。細胞內(nèi)外的多種分子和信號通路參與其中,通過與細胞內(nèi)外的不同分子相互作用,激活胞內(nèi)不同的信號通路,各種信號通路相互交錯形成復雜的網(wǎng)絡,調(diào)控EMT的發(fā)生。其中,NF-κB信號通路,無論在與癌癥發(fā)生發(fā)展密切相關的炎癥發(fā)展過程,還是在癌癥原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶的形成和發(fā)展中,都發(fā)揮著重要的作用[5,6]。其激活不僅是宿主抵抗感染及壓力等所引起的炎癥反應的中心環(huán)節(jié)。在癌癥中,NF-κB也可通過上調(diào)多種調(diào)節(jié)細胞生存、增殖、遷移、侵襲的基因,同時對抗生長調(diào)節(jié)因子如抑癌基因p53等,發(fā)揮促進癌癥發(fā)展的作用[5]。NF-κB下游一系列重要分子,尤其是鋅指蛋白snail,參與NF-κB調(diào)節(jié)的多種癌癥的發(fā)生發(fā)展過程。Snail可受NF-κB的誘導,為在EMT及癌癥發(fā)生過程中,表達明顯上調(diào)的多個轉(zhuǎn)錄因子之一。其激活后,可明顯抑制在癌癥EMT及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮核心作用的鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達。有研究表明,snail不僅可調(diào)控上皮腫瘤細胞及間質(zhì)宿主細胞的細胞結構,還可調(diào)節(jié)腫瘤細胞和宿主細胞之間的旁分泌過程及一系列信號通路,進而影響腫瘤轉(zhuǎn)移的過程。因此,在腫瘤細胞中,snail的表達可以促進腫瘤EMT的發(fā)生,并為腫瘤干性及運動能力不可或缺的重要特征[7]。脂質(zhì)運載蛋白2(Lipocalin2,LCN2),又稱中性粒細胞白明膠酶-相關脂質(zhì)運載蛋白(Netrophilgelatinase-associated Lipocalin2,NGAL),最初發(fā)現(xiàn)其可通過結合細菌生長所必需的鐵離子從而抑制細菌的生長,參與固有免疫反應過程[8]。近年,大量研究表明LCN2在多種腫瘤中表達上調(diào),參與腫瘤形成及轉(zhuǎn)移的過程。但研究報道的其參與腫瘤進展的具體機制仍不清楚。如LCN2可以抑制肝細胞癌的EMT發(fā)生及轉(zhuǎn)移,并且可以抑制胰腺癌的侵襲及血管生成;而在前列腺癌和肝癌中,LCN2則可通過調(diào)節(jié)不同通路從而促進EMT的發(fā)生。另外,LCN2還可在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運視黃醇,近年研究報道,其在細胞內(nèi)發(fā)揮作用的主要形式,全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程,但其在不同腫瘤中的具體分子機制研究仍不明確。因此,本研究的主要目的是明確LCN2在結直腸癌中EMT發(fā)生過程中的作用,并探索具體的分子機制;同時探索ATRA是否在結直腸癌EMT發(fā)生過程中發(fā)揮作用,其對EMT的作用是否與LCN2有關。為了明確LCN2在結直腸癌EMT及轉(zhuǎn)移中的作用,我們采取將LCN2敲除或過表達的實驗方法,從體內(nèi)及體外兩個方面,對EMT相關標志物及生物學行為,進行了驗證;并在臨床樣本中,對LCN2與EMT相關標志物的關系及其對預后的意義進行了分析。我們將構建好的含shRNA-LCN2慢病毒載體,感染LCN2高表達的細胞系SW480和HT29,將含LCN2-CDS區(qū)的慢病毒載體感染LCN2低表達的結直腸癌細胞系SW620和RKO,通過real-time qPCR及western blot的方法檢測相關指標的mRNA及蛋白水平的變化;劃痕實驗檢測結直腸癌細胞的運動能力改變;CCK8、克隆形成實驗檢測細胞增殖能力的變化;transwell小室方法檢測細胞遷移、侵襲等生物學行為的變化;同時,我們也建立了裸鼠原位移植瘤模型及肺部轉(zhuǎn)移模型,在動物體內(nèi)觀察LCN2對腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的影響;最后分析臨床樣本中LCN2與相關指標的關系,及對結直腸癌病人預后的影響,明確LCN2在結直腸癌EMT中的作用及其臨床意義。結果發(fā)現(xiàn),LCN2敲除后可明顯下調(diào)上皮標志物鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達,上調(diào)間質(zhì)標志物波形蛋白(vimentin)的表達;增強細胞增殖、遷移、侵襲的能力;過表達LCN2后則抑制了EMT的發(fā)生及細胞增殖、遷移、侵襲能力。體內(nèi)實驗也證實,敲除LCN2后腫瘤生長速度、瘤體體積均明顯高于轉(zhuǎn)染空載體組,而過表達LCN2后腫瘤的生長則受到明顯抑制;肺部轉(zhuǎn)移實驗也表明,過表達LCN2后裸鼠肺部轉(zhuǎn)移灶的形成數(shù)量明顯少于轉(zhuǎn)染空載體組,提示LCN2可抑制結直腸癌中EMT的發(fā)生。為了進一步探索LCN2對EMT的抑制作用是否與NF-κB通路有關,我們在敲除或過表達LCN2的細胞系中,檢測NF-κB及其磷酸化水平和snail表達變化的基礎上,改變NF-κB及snail的活性或表達,觀察相應生物學行為的改變及分子水平的表達情況,明確NF-κB/snail信號通路在LCN2調(diào)控的EMT過程中的作用。我們發(fā)現(xiàn),敲除LCN2后,NF-κB的磷酸化水平、在細胞核內(nèi)的聚集及其下游因子snail的表達明顯升高,免疫熒光實驗結果顯示,LCN2敲除后,snail的熒光強度及其在細胞核內(nèi)的分布明顯增強;在過表達LCN2的細胞系中,NF-κB的表達、磷酸化水平及snail的表達則明顯降低,snail在細胞核內(nèi)的聚集及熒光強度明顯減弱;熒光素酶報告基因的實驗結果也表明,過表達LCN2可明顯削弱NF-κB的啟動子活性。隨后我們選取結直腸癌細胞系SW480及SW620,分別外源加入20nM的NF-κB激活性leptomycinB(LMB)及50nM的NF-κB抑制劑Bay11-7082,檢測NF-κB對結直腸癌EMT相關指標的影響。結果表明,NF-κB可明顯下調(diào)E-cadherin的表達,上調(diào)vimentin及snail的表達,表明NF-κB在結直腸癌中促進EMT的發(fā)生。以上結果提示,NF-κB/snail信號通路可能在LCN2調(diào)節(jié)的EMT中發(fā)揮作用。為了進一步探討NF-κB/snail信號通路在LCN2調(diào)節(jié)的EMT中可能發(fā)揮的作用,我們分別通過在敲除LCN2的SW480細胞系中外源加入0.05nM sip65減弱NF-κB表達,在過表達LCN2的SW620細胞系中外源加入NF-κB激活劑LMB增強其表達,及轉(zhuǎn)染snail的過表達質(zhì)�；謴蛃nail的表達,來明確LCN2是否可通過調(diào)節(jié)NF-κB/snail信號通路,發(fā)揮抑制結直腸癌EMT的作用。我們同樣采用real-time qPCR及western blot方法,檢測EMT相關指標的變化。結果顯示,在LCN2敲除的細胞系SW480中,NF-κB的干擾可上調(diào)LCN2敲除引起的E-cadherin、ZO-1的下降,下調(diào)LCN2敲除誘發(fā)的vimentin及snail表達的上調(diào);而在LCN2過表達的SW620細胞系中,恢復下降的NF-κB的表達后,則明顯逆轉(zhuǎn)過表達LCN2引起的E-cadherin、ZO-1表達的增加,vimentin及snail表達的減少;而在LCN2過表達的細胞系中恢復snail的表達后,同樣可減弱LCN2對E-cadherin、ZO-1、vimentin和snail及遷移能力的影響。我們對結直腸癌病人臨床組織樣本,運用免疫組織化學方法,檢測了LCN2、E-cadherin、β-catenin、增殖標志物Ki67,以及NF-κB的表達,并分析LCN2與E-cadherin、β-catenin以及Ki67三個EMT重要標志物的關系及LCN2及NF-κB的表達對結直腸癌預后的臨床意義。結果證實,LCN2在結直腸癌原發(fā)灶中的表達明顯高于淋巴結轉(zhuǎn)移灶中的表達;且LCN2與E-cadherin呈明顯正相關,與核內(nèi)β-catenin的分布,及Ki67呈明顯負相關;裸鼠體內(nèi)成瘤的組織切片染色中也發(fā)現(xiàn),LCN2與E-cadherin的變化水平相一致,與vimentin及Ki67的變化水平相反。而且根據(jù)LCN2及NF-κB的表達進行分組發(fā)現(xiàn),LCN2表達陽性且NF-κB表達陰性的病人,其組織切片中snail在核內(nèi)的分布明顯較低,預后及五年生存率明顯較好。最后,我們對ATRA在LCN2調(diào)控的結直腸癌EMT中的作用進行了探索。在內(nèi)源性表達LCN2的SW480細胞系中,加入較高生理濃度的ATRA,檢測其對EMT標志物、LCN2及遷移的影響。我們發(fā)現(xiàn),ATRA可明顯上調(diào)結直腸癌細胞中E-cadherin的表達及LCN2的水平,抑制vimentin的表達,NF-κB/snail信號通路的活性及細胞的遷移能力。LCN2特異性抗體可明顯逆轉(zhuǎn)ATRA引起的上皮表型變化及遷移能力的下調(diào)。綜合上述研究結果,我們得出以下結論:1.在結直腸癌細胞系及裸鼠體內(nèi),LCN2可上調(diào)上皮標志物表達,下調(diào)間質(zhì)標志物的表達,同時抑制細胞增殖,遷移和侵襲及腫瘤形成及轉(zhuǎn)移能力;從而抑制結直腸癌中EMT及轉(zhuǎn)移的發(fā)生。2.在結直腸癌細胞中,LCN2可通過抑制NF-κB/snail信號通路抑制結直腸癌中EMT的發(fā)生;LCN2表達陽性且NF-κB表達陰性的結直腸癌患者,其預后及五年生存率較好;因此LCN2/NF-κB/snail信號通路可能成為結直腸癌治療的新靶點。3.在結直腸癌細胞中,ATRA可依賴LCN2,發(fā)揮抑制EMT的發(fā)生及NF-KB/snail信號通路的活性及結直腸癌細胞的遷移的作用。因此,ATRA可能可應用于臨床結直腸癌的治療。
文內(nèi)圖片：
圖片說明：圖３－１邋ｐＬＶＸ－ｓｈＲＮＡ２干擾載體及ｐＬＶＸＪＲＥＳ－ＺｓＧｒｅｅｎ邋１表達載體圖譜逡逑１７逡逑
文內(nèi)圖片：
圖片說明： ＬＣＮ２的表達情況進行檢測。結果表明，只有ＳＷ６２０和民ＫＯ兩株細胞系中ＬＣＮ２表逡逑達較低，我們隨后選取這兩株細胞系進行后續(xù)的ＬＣＮ２過表達實驗，選取ＳＷ４８０和逡逑ＨＴ２９細胞系進行ＬＣＮ２敲除的實驗（圖４－１）。逡逑ＧＡＰ邋Ｄ邋Ｈ逡逑ＬＣＮ２邋一 邋？一邋￣？邋邐邐—一逡逑ＧＡＰＤＨ邋邐—邐邐逡逑困４－１邋ＬＣＮ２在結直腸癌細胞系中ｍＲＮＡ及蛋白水平的表達逡逑４．１．２邋ＬＣＮ２在結直腸癌組織中的表達逡逑４．１．２．１邐ＬＣＮ２在結直腸癌組織和正常組織中的表達逡逑我們在７對配對的結直腸癌組織和癌旁組織中對ＬＣＮ２的表達進行的檢測結果也顯逡逑示，ＬＣＮ２在癌癥組織中的表達（４／７）明顯高于癌旁組織（１／７）（圖４－２Ａ）。利逡逑用ＴＣＧＡ數(shù)據(jù)庫信息，我們在１５例配對的腫瘤組織與正常組織（男３例，女１２例）逡逑中，對ＬＣＮ２的ＲＮＡ表達水平進行的分析也證實，ＬＣＮ２在結直腸癌紐織中的表達逡逑（均值８４．８５）明癥高于正常組織（均值４８．３５邋）邋（Ｐ＝０．０３６）（圖４－２Ｂ）。隨后在結逡逑直腸癌原發(fā)灶組織和淋己結轉(zhuǎn)移灶組織中，進行免疫紐織化學檢測ＬＣＮ２的表達，，逡逑４２逡逑
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.34

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 王漢濤 ,Kraemer M.;隨訪危險因素分析:復發(fā)和非復發(fā)結直腸癌的比較[J];中國實用外科雜志;2001年12期

2 蘇森;患結直腸癌婦女后代癌癥的危險性增加[J];中國腫瘤;2001年06期

3 汪一虹;在確定的法國人群中年齡<45歲結直腸癌病人與≥45歲結直腸癌病人的比較[J];國外醫(yī)學(消化系疾病分冊);2002年01期

4 李會晨;結直腸癌解剖位置的連續(xù)性右向遷移[J];國外醫(yī)學.外科學分冊;2003年03期

5 李志霞;結直腸癌復發(fā)及轉(zhuǎn)移的綜合治療[J];中華胃腸外科雜志;2003年06期

6 何建苗,蒲永東,曹志宇,劉衛(wèi)平;老年人結直腸癌186例的外科治療[J];中華胃腸外科雜志;2003年05期

7 保紅平,方登華,高瑞崗,李奎,張雪松,劉天錫;青年人結直腸癌臨床病理分析[J];中國普外基礎與臨床雜志;2004年01期

8 章江;;監(jiān)測結直腸癌非常必要[J];國外醫(yī)學情報;2004年04期

9 郜文秀,楊艷芳,梁小波,李耀平,李佩珍;細胞粘附分子變異體在結直腸癌中的表達及預后[J];中國公共衛(wèi)生;2005年07期

10 Nozawa T. ,Enomoto T. ,Koshida Y. ,M. Kuranami,王志宇;人結直腸癌黏膜下血小板源性內(nèi)皮細胞生長因子特異性增強表達[J];世界核心醫(yī)學期刊文摘(胃腸病學分冊);2005年06期

相關會議論文 前10條

1 鄭樹;;結直腸癌預后與轉(zhuǎn)移相關因素分析[A];2005年浙江省腫瘤學術會議全國大腸癌轉(zhuǎn)移與復發(fā)的診治研討會學術論文集[C];2005年

2 鄒一峰;吳小劍;蘭平;;結直腸癌免疫治療新進展[A];第十一次全國中西醫(yī)結合大腸肛門病學術會議論文匯編[C];2006年

3 郁寶銘;;結直腸癌治療的進展及其新理念[A];2006年浙江省肛腸外科學術年會論文匯編[C];2006年

4 王錫山;;結直腸癌治療的困惑之我見[A];第九屆全國腫瘤轉(zhuǎn)移學術大會暨2011年黑龍江省醫(yī)學會腫瘤學年會報告集[C];2011年

5 秦建平;;未病思想中的結直腸癌預防[A];貴州省中西醫(yī)結合學會肛腸學會第五屆學術交流會暨新技術新進展學習班論文匯編[C];2012年

6 高文慶;陳會林;童蕾;陸松春;;老年梗阻性結直腸癌診療體會(附42例報告)[A];首屆“之江中醫(yī)藥論壇”暨浙江省中醫(yī)藥學會2011年學術年會論文集[C];2011年

7 王啟遠;周長江;高云飛;徐巖;李坤;;血管內(nèi)皮生長因子與結直腸癌[A];《中華急診醫(yī)學雜志》第八屆組稿會暨急診醫(yī)學首屆青年論壇論文匯編[C];2009年

8 巴一;;結直腸癌靶向治療進展[A];第三屆中國腫瘤內(nèi)科大會教育集暨論文集[C];2009年

9 何超;朱洪波;;結直腸癌的生物治療[A];2009年浙江省腫瘤外科學術年會暨腫瘤外科規(guī)范化診治學習班論文匯編[C];2009年

10 萬德森;;進一步提高結直腸癌療效的思考[A];2009年浙江省腫瘤學術年會暨腫瘤診治新進展學習班論文匯編[C];2009年

相關重要報紙文章 前10條

1 中華醫(yī)學會腫瘤學分會主任委員 顧晉;分期不精確 致結直腸癌過度治療[N];健康報;2012年

2 本報記者 賈巖;跨線治療成結直腸癌最后防線[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2012年

3 本報記者 賈巖;跨線治療構筑結直腸癌最后防線[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2012年

4 本報記者 林琳;結直腸癌：可以治愈的癌癥[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2013年

5 記者 張妍　通訊員 熊靜帆 朱品磊;深圳結直腸癌發(fā)病高于全國[N];深圳商報;2013年

6 本報記者 孫剛;預防結直腸癌：請管住嘴[N];解放日報;2013年

7 上海市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科 侯鳳剛 副主任醫(yī)師;中醫(yī)藥在結直腸癌治療中的作用和特色[N];上海中醫(yī)藥報;2014年

8 李華虹 孫瑜淼 記者 李麗云 實習生 陰浩;專家呼吁：結直腸癌應多學科規(guī)范化診療[N];科技日報;2014年

9 ;降低結直腸癌復發(fā)有新療法[N];人民日報;2003年

10 韓自力;新化療方案可高效治療結直腸癌[N];健康報;2007年

相關博士學位論文 前10條

1 陳濤;MicroRNA-31/FIH-1調(diào)控關系在結直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制研究[D];復旦大學;2014年

2 任翡;MYBL2基因在結直腸癌的表達及機制的初步探討[D];復旦大學;2014年

3 吳朋;結直腸癌中microRNA-615基因甲基化及其生物學特性探究[D];復旦大學;2014年

4 李澤武;MicroRNA-203靶向ZNF217基因調(diào)控結直腸癌生物學行為的研究[D];山東大學;2015年

5 徐興遠;低分子肝素對結直腸癌患者預后的影響及相關機制的研究[D];復旦大學;2014年

6 梁洪亮;miR-454在結直腸癌中的功能及其作用機制[D];山東大學;2015年

7 金鵬;MMR蛋白在雌激素致結腸癌細胞凋亡中的作用及SEPT9檢測結直腸癌的研究[D];第三軍醫(yī)大學;2015年

8 珠珠;云南省Lynch綜合征候選基因標志物研究[D];昆明醫(yī)科大學;2014年

9 周智航;SEMA3F通過下調(diào)ASCL2-CXCR4軸而抑制結直腸癌轉(zhuǎn)移的分子機制[D];第三軍醫(yī)大學;2015年

10 王林;MiRNA-300對結直腸癌腫瘤侵襲和增殖的影響及其調(diào)控機制的初步研究[D];第三軍醫(yī)大學;2015年

相關碩士學位論文 前10條

1 顏斐斐;術后結直腸癌患者癌因性疲乏與影響因素的研究[D];南方醫(yī)科大學;2009年

2 李斌;結直腸癌患者就診延遲分析[D];中南大學;2009年

3 葉建杰;慈溪市結直腸癌危險因素病例對照研究[D];浙江大學;2008年

4 趙波;結直腸癌危險因素及臨床流行病學特征的調(diào)查與分析[D];廣西醫(yī)科大學;2013年

5 宋艷敏;PAQR3基因甲基化水平與結直腸癌關系的研究[D];河北大學;2015年

6 黎江;Oct4B1在結直腸癌干細胞中的表達及其與Twist的相關性研究[D];遵義醫(yī)學院;2015年

7 楊文婷;PD-L1、SIRT1在結直腸癌組織中的表達及意義[D];福建醫(yī)科大學;2015年

8 羅佳;二代測序分析散發(fā)性結直腸癌和息肉的基因突變[D];福建醫(yī)科大學;2015年

9 崔慧鵬;精氨酸琥珀酸合成酶（ASS1）高表達與結直腸癌惡性進展的相關性研究[D];中國人民解放軍醫(yī)學院;2015年

10 崔娟娟;p53和nm23在結直腸癌中的表達及其臨床意義[D];河北聯(lián)合大學;2014年

本文編號：2514878