【摘要】：研究背景及目的:惡性腫瘤的發(fā)病率和致死率逐年攀升,已經(jīng)成為威脅人類(lèi)生命健康的主要疾病。食管癌是人類(lèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,具有明顯地域差別,中國(guó)的發(fā)病率與死亡率均居世界第一。在我國(guó),90%的食管癌患者為食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC,食管鱗癌),通常發(fā)現(xiàn)較晚,盡管治療手段不斷進(jìn)步,但是5年生存率僅為10%左右。為了進(jìn)一步提高食管癌患者的生存期和生活質(zhì)量,研究影響食管癌患者預(yù)后的因素、精準(zhǔn)的治療靶點(diǎn)和開(kāi)發(fā)新的治療手段迫在眉睫。近年來(lái),免疫治療在實(shí)體瘤中的應(yīng)用顯示了巨大的潛力,并在腫瘤的治療中取得了一席之地,同時(shí)過(guò)繼性T細(xì)胞治療在腫瘤治療中的地位也與日俱增,目前以腫瘤相關(guān)性抗原作為T(mén)細(xì)胞治療的靶點(diǎn)已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段,如疫苗治療和基因工程化T細(xì)胞治療。癌睪抗原是一類(lèi)在腫瘤組織中高表達(dá),僅在部分正常組織(生殖系統(tǒng),睪丸和胎盤(pán)組織)中限制性表達(dá)的蛋白,而生殖系統(tǒng)為免疫豁免器官,因此癌睪抗原可以作為腫瘤免疫治療的理想靶點(diǎn)。癌睪抗原的表達(dá)同腫瘤的生長(zhǎng)、患者的生存期和疾病的復(fù)發(fā)相關(guān),在體外實(shí)驗(yàn)中下調(diào)癌睪抗原的表達(dá)能夠改變腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性,降低其粘附和侵襲轉(zhuǎn)移能力,此外癌睪抗原的表達(dá)可以作為多種惡性腫瘤不良預(yù)后的指標(biāo)。在過(guò)去的研究中,一些HLA-I類(lèi)分子限制的癌睪抗原肽段已被鑒定出來(lái)。同時(shí)抗原特異性T細(xì)胞在提高疾病的預(yù)后方面發(fā)揮著作用,已有報(bào)道評(píng)估了經(jīng)NY-ESO-1和MAGE-A3疫苗免疫治療過(guò)的黑色瘤患者體內(nèi)特異性T細(xì)胞的比例,T細(xì)胞的頻度和功能同患者的預(yù)后相關(guān),抗原特異性T細(xì)胞能夠明顯提高患者的緩解率并延長(zhǎng)腫瘤患者的生存期。然而癌睪抗原的表達(dá)以及其誘發(fā)的T細(xì)胞免疫反應(yīng)在食管癌中鮮有報(bào)道,此外,抗原特異性T細(xì)胞在腫瘤部位的功能往往是受損的。腫瘤微環(huán)境中,存在很多影響T細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤功能的因素,如T細(xì)胞本身在活化的過(guò)程中會(huì)高表達(dá)一系列抑制性分子包括程序化死亡受體1(Programmed death-1,PD-1)和細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)等,針對(duì)T細(xì)胞表面的抑制性分子已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一系列的單克隆抗體,尤其是靶向免疫檢查點(diǎn)PD-1/CTLA-4的治療在多種惡性腫瘤中顯示了驚人的療效,但腫瘤微環(huán)境中仍存在一些影響T細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤功能的因素,如腫瘤微環(huán)境中的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞的凋亡并能抑制T細(xì)胞功能的發(fā)揮,并有文獻(xiàn)證實(shí)腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生活性氧而抑制T細(xì)胞的活化和功能,而應(yīng)用活性氧清除劑谷胱甘肽聯(lián)合PD-1/PD-L1的阻斷是否能夠協(xié)同抑制T細(xì)胞的凋亡和促進(jìn)T細(xì)胞功能的恢復(fù)尚無(wú)報(bào)道。本研究旨在檢測(cè)癌睪抗原在食管癌腫瘤組織中的表達(dá)并分析其同臨床參數(shù)之間的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)MAGE-A3和MAGE-C2在食管癌腫瘤組織中高表達(dá),并同不良預(yù)后相關(guān)。進(jìn)一步檢測(cè)了MAGE-A3特異性CD8+T細(xì)胞在食管癌患者外周血中的比例和功能,并分析其比例和功能同食管癌臨床參數(shù)之間的相關(guān)性,證實(shí)了PD-1在低反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞和腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞表面高表達(dá),PD-1+CD8+T細(xì)胞功能受損,阻斷PD-1/PD-L1通路能夠在一定程度上增加MAGE-A3特異性T細(xì)胞的增殖能力和殺傷功能。腫瘤微環(huán)境中能夠產(chǎn)生大量的活性氧,PD-1+CD8+T細(xì)胞活性氧的表達(dá)水平升高,進(jìn)一步探討了活性氧清除劑谷胱甘肽聯(lián)合PD-1/PD-L1阻斷協(xié)同增強(qiáng)T細(xì)胞的抗腫瘤效果。第一部分癌睪抗原在食管癌腫瘤組織中的表達(dá)及其臨床意義方法1)RT-PCR檢測(cè)MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2和NY-ESO-1在食管癌腫瘤組織中的表達(dá)。2)分析癌睪抗原基因的表達(dá)同臨床參數(shù)之間的相關(guān)性。3)免疫組化分析MAGE-A3和MAGE-C2在食管癌組織中的表達(dá)并探討同預(yù)后之間的聯(lián)系。4)體外實(shí)驗(yàn)探討MAGE-A3/MAGE-C2對(duì)腫瘤細(xì)胞系生物學(xué)特性的影響。結(jié)果1)癌睪抗原在正常組織中不表達(dá),在食管癌腫瘤組織中高表達(dá),并具有較高的陽(yáng)性率。2)MAGE-A3和MAGE-C2的表達(dá)同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期相關(guān)。3)MAGE-A3陽(yáng)性患者的生存期較MAGE-A3陰性患者生存期差,并能夠作為一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。4)MAGE-A3和MAGE-C2同腫瘤細(xì)胞株的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān),下調(diào)MAGE-A3/C2的表達(dá)能夠降低腫瘤細(xì)胞株的成球能力和侵襲轉(zhuǎn)移能力,并誘導(dǎo)間質(zhì)向上皮轉(zhuǎn)化。小結(jié)癌睪抗原在食管癌組織中具有較高的陽(yáng)性率,MAGE-A3的表達(dá)可作為一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo),通過(guò)改變腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化影響腫瘤細(xì)胞的成球能力和侵襲轉(zhuǎn)移能力,并可以作為免疫治療潛在的靶點(diǎn)。第二部分MAGE-A3抗原特異性T細(xì)胞的比例和功能在食管癌患者中的臨床意義方法1)選擇HLA-A2和MAGE-A3共陽(yáng)性的患者,體外培養(yǎng)MAGE-A3抗原特異性CD8+T細(xì)胞,用MAGE-A3-Tetramer(KVAELVHFL)標(biāo)記腫瘤抗原特異性T細(xì)胞。2)IFN-g-ELSPOT和PI-Annexin V雙染法分別檢測(cè)了Tetramer+/CD8+T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷能力。3)流式檢測(cè)Tetramer+/CD8+T細(xì)胞的比例,分析MAGE-A3抗原特異性T細(xì)胞的比例和功能同臨床資料之間的相關(guān)性。結(jié)果1)MAGE-A3-Tetramer+/CD8+T細(xì)胞在外周血中比例很低(0.01%),經(jīng)負(fù)載肽段的DC刺激14d后,Tetramer+/CD8+T細(xì)胞的比例均高于0.2%以上。Tetramer+/CD8+T細(xì)胞能夠?qū)LA-A2+/MAGE-A3+食管癌細(xì)胞株產(chǎn)生特異性殺傷(MAGE-A3抗原特異性CD8+T細(xì)胞在體外具有殺傷腫瘤細(xì)胞的功能,并能夠分泌CD107a和IFN-g)。2)Tetramer+/CD8+T細(xì)胞的比例與年齡呈正相關(guān),而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期呈負(fù)相關(guān)(P0.05)。CD107a的表達(dá)水平與臨床預(yù)后不良的參數(shù)呈負(fù)相關(guān)(如:淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期和腫瘤體積)(P0.05)。3)功能性Tetramer+/CD8+T細(xì)的比例能夠提示患者的預(yù)后。小結(jié)MAGE-A3-Tetramer+/CD8+T細(xì)胞具有特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的功能,Tetramer+/CD8+T細(xì)胞的功能可作為預(yù)測(cè)食管癌預(yù)后的指標(biāo),有功能的MAGE-A3-Tetramer+/CD8+T細(xì)胞的比例與患者的生存期呈正相關(guān)。本研究為靶向MAGE-A3抗原的疫苗治療和TCR基因修飾T細(xì)胞治療提供理論依據(jù)。第三部分PD-1在食管癌患者無(wú)反應(yīng)性T細(xì)胞表面高表達(dá)方法1)流式檢測(cè)MAGE-A3抗原特異性CD8+T細(xì)胞上PD-1的表達(dá)。2)分選CD107a+/IFN-g+和CD107a-/IFN-g-MAGE-A3抗原特異性CD8+T細(xì)胞,Real-time PCR檢測(cè)CD107a+/IFN-g+和CD107a-/IFN-g-的MAGE-A3抗原特異性CD8+T細(xì)胞PD-1的表達(dá)差異。3)流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血、腫瘤組織和配對(duì)正常組織浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞表面PD-1的表達(dá),并比較了腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中PD-1+CD8+T細(xì)胞和PD-1-CD8+T細(xì)胞功能的差異;對(duì)比了腫瘤組織和配對(duì)正常組織中抗原遞呈細(xì)胞和上皮源性細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)。4)檢測(cè)了阻斷PD-1/PD-L1對(duì)MAGE-A3特異性CD8+T細(xì)胞增殖能力和功能的影響。結(jié)果1)PD-1在無(wú)反應(yīng)性MAGE-A3特異性CD8+T細(xì)胞和腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞表面高表達(dá)。2)PD-L1在腫瘤組織中高表達(dá),腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中的PD-1+CD8+T細(xì)胞功能受限。3)阻斷PD-1/PD-L1能夠在一定程度上增加MAGE-A3特異性CD8+T細(xì)胞的增殖和分泌內(nèi)因子的功能。小結(jié)食管癌患者腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+T淋巴細(xì)胞表面高表達(dá)PD-1,且PD-1+CD8+T細(xì)胞功能受限。通過(guò)阻斷PD-1/PD-L1能夠一定程度上增加MAGE-A3特異性CD8+T細(xì)胞的增殖能力和功能。第四部分谷胱甘肽聯(lián)合阻斷PD-1/PD-L1通路協(xié)同增強(qiáng)MAGE-A3抗原特異性CD8+T細(xì)胞的抗腫瘤效果方法1)檢測(cè)PD-1+/PD-1-CD8+T細(xì)胞凋亡的差異和活性氧表達(dá)的差異。2)檢測(cè)活性氧清除劑谷胱甘肽對(duì)T細(xì)胞的ROS水平、凋亡和功能的影響。3)體外檢測(cè)谷胱甘肽聯(lián)合PD-1/PD-L1阻斷對(duì)CD8+T細(xì)胞功能的影響。4)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在T細(xì)胞回輸?shù)幕A(chǔ)上聯(lián)合應(yīng)用谷胱甘肽和PD-1/PD-L1阻斷對(duì)食管癌荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響。5)分離荷瘤小鼠腫瘤組織中的浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞治療組CD8+在腫瘤部位浸潤(rùn)的數(shù)目和分泌內(nèi)因子的功能。結(jié)果1)PD-1+CD8+T細(xì)胞較PD-1-CD8+T細(xì)胞的ROS水平較高,且凋亡細(xì)胞比例明顯高于PD-1-CD8+T細(xì)胞。2)谷胱甘肽能夠清除CD8+T細(xì)胞的ROS,減少PD-1+CD8+T細(xì)胞的凋亡。3)谷胱甘肽聯(lián)合阻斷PD-1/PD-L1協(xié)同增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞增殖能力和分泌內(nèi)因子的功能。4)在體內(nèi)試驗(yàn)中,谷胱甘肽能夠協(xié)同增加阻斷PD-1/PD-L1對(duì)CD8+T細(xì)胞的抗腫瘤的功能,延緩腫瘤的生長(zhǎng)。5)谷胱甘肽聯(lián)合PD-1/PD-L1阻斷能夠增加腫瘤部位浸潤(rùn)性CD8+T細(xì)胞的絕對(duì)數(shù),同時(shí)增強(qiáng)其分泌內(nèi)因子的能力。小結(jié)PD-1+CD8+T細(xì)胞具有較高水平的ROS和凋亡比例。谷胱甘肽聯(lián)合PD-1/PD-L1阻斷協(xié)同減少ROS水平和細(xì)胞凋亡比例,增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞增殖能力和分泌內(nèi)因子的功能。谷胱甘肽聯(lián)合PD-1/PD-L1阻斷產(chǎn)生協(xié)同的抗腫瘤作用。結(jié)論1)癌睪抗原MAGE-A3在食管癌腫瘤組織中具有較高的陽(yáng)性率,MAGE-A3的表達(dá)并可以作為一個(gè)獨(dú)立評(píng)價(jià)食管癌預(yù)后的指標(biāo)。2)MAGE-A3特異性CD8+T細(xì)胞能夠特異性殺傷HLA-A2+/MAGE-A3+腫瘤細(xì)胞,功能性MAGE-A3特異性CD8+T細(xì)胞的比例能夠預(yù)測(cè)食管癌的預(yù)后。3)PD-1在MAGE-A3特異性CD8+T細(xì)胞和食管癌腫瘤浸潤(rùn)淋巴表面高表達(dá),阻斷PD-1/PD-L1能夠一定程度上增加MAGE-A3特異性CD8+T細(xì)胞的比例和功能。4)谷胱甘肽聯(lián)合阻斷PD-1/PD-L1通路協(xié)同減少ROS的水平和細(xì)胞凋亡比例,增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞分泌內(nèi)因子的功能。谷胱甘肽聯(lián)合PD-1/PD-L1阻斷產(chǎn)生協(xié)同的抗腫瘤作用。
文內(nèi)圖片：
圖片說(shuō)明： 圖 1.1 癌睪抗原在食管癌組織中的表達(dá)癌睪抗原基因在腫瘤組組織中的表達(dá)（代表性結(jié)果），M：marker, 1-陽(yáng)性對(duì)照，2，3-10，食管癌腫瘤標(biāo)本。B：四個(gè)癌睪抗原基因在食管癌腫瘤組織中的累積表達(dá)食管癌標(biāo)本不表達(dá)任何一個(gè)癌睪抗原基因，15% 的標(biāo)本表達(dá)一個(gè)，27% 的標(biāo)本表38%的標(biāo)本表達(dá)三個(gè)，13% 的標(biāo)本表達(dá)四個(gè)癌睪抗原基因。C：四個(gè)癌睪抗原基例食管癌腫瘤組織中的表達(dá)情況，數(shù)字代表在 193 例食管癌標(biāo)本中的陽(yáng)性例數(shù)。 癌睪抗原（mRNA 水平）的表達(dá)與臨床參數(shù)之間的相關(guān)性分析為了闡明癌睪抗原 mRNA 水平的表達(dá)與食管鱗癌臨床疾病進(jìn)展之間我們分析了 MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2 和 NY-ESO-1 mRNA 的床病理參數(shù)之間的關(guān)系（表 1.2）。MAGE-A3 的表達(dá)與年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)分期有相關(guān)性，在年齡<65 歲或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或腫瘤分期較晚的患者群里GE-A3 陽(yáng)性率較高（P<0.05）。這些結(jié)果提示 MAGE-A3 在 mRNA 表達(dá)癌患者的疾病進(jìn)展密切相關(guān)，，MAGE-A3 mRNA 水平的表達(dá)可作為預(yù)示進(jìn)展的標(biāo)志物。而 MAGE-C2 與腫瘤的分期正相關(guān)，分期越晚，陽(yáng)性率
文內(nèi)圖片：
圖片說(shuō)明： 3.3 MAGE-A3 和 MAGE-C2（蛋白表達(dá)水平）同臨床參數(shù)之間的相關(guān)分析前期 mRNA 水平結(jié)果顯示 MAGE-A3 和 MAGE-C2 同食管癌疾病的進(jìn)展一定的內(nèi)在聯(lián)系，為了進(jìn)一步闡明 MAGE-A3 和 MAGE-C2 蛋白在食管鱗癌發(fā)發(fā)展中的作用，我們應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)了 MAGE-A3 和 MAGE-C2 蛋白水在食管癌腫瘤組織中的表達(dá)，并分析了其表達(dá)同食管鱗癌患者臨床參數(shù)之間關(guān)系（表 1.4）。結(jié)果顯示：MAGE-A3 和 MAGE-C2 在食管癌腫瘤組織中的陽(yáng)率分別為 71%和 56%，同臨床資料的相關(guān)性分析結(jié)果如表 1.4 所示，MAGE和 MAGE-C2 蛋白水平的表達(dá)與食管鱗癌患者的性別和年齡無(wú)關(guān)（P>0.05），與食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期、分化程度及腫瘤浸潤(rùn)深度相關(guān)（P<0.05淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期較晚的患者 MAGE-A3 和 MAGE-C2 共陽(yáng)性比例較高疫組化檢測(cè) MAGE-A3/C2 在食管癌腫瘤組織中的表達(dá)的代表性結(jié)果、陽(yáng)性對(duì)和陰性對(duì)照（圖 1.2）。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R735.1

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 吉曉濱;呂景禮;陳敬賢;劉啟才;謝景華;;SEA和喉癌MAGE-A3基因重組真核共表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2012年18期

2 李寧;吉曉濱;謝景華;劉啟才;;SEA和喉癌MAGE-A3構(gòu)建的真核質(zhì)粒pMAGEA3-IRES-SEA經(jīng)過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)染在小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2014年01期

3 ;[J];;年期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 陳新峰;食管癌中癌睪抗原的表達(dá)及MAGE-A3特異性T細(xì)胞抗腫瘤作用影響因素的研究[D];鄭州大學(xué);2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 周安秀;MAGE-A3在鼻咽癌的表達(dá)及意義[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2514582