【摘要】：研究背景及目的:惡性腫瘤的發(fā)病率和致死率逐年攀升,已經(jīng)成為威脅人類生命健康的主要疾病。食管癌是人類常見的惡性腫瘤之一,具有明顯地域差別,中國的發(fā)病率與死亡率均居世界第一。在我國,90%的食管癌患者為食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC,食管鱗癌),通常發(fā)現(xiàn)較晚,盡管治療手段不斷進步,但是5年生存率僅為10%左右。為了進一步提高食管癌患者的生存期和生活質(zhì)量,研究影響食管癌患者預(yù)后的因素、精準的治療靶點和開發(fā)新的治療手段迫在眉睫。近年來,免疫治療在實體瘤中的應(yīng)用顯示了巨大的潛力,并在腫瘤的治療中取得了一席之地,同時過繼性T細胞治療在腫瘤治療中的地位也與日俱增,目前以腫瘤相關(guān)性抗原作為T細胞治療的靶點已進入臨床試驗階段,如疫苗治療和基因工程化T細胞治療。癌睪抗原是一類在腫瘤組織中高表達,僅在部分正常組織(生殖系統(tǒng),睪丸和胎盤組織)中限制性表達的蛋白,而生殖系統(tǒng)為免疫豁免器官,因此癌睪抗原可以作為腫瘤免疫治療的理想靶點。癌睪抗原的表達同腫瘤的生長、患者的生存期和疾病的復(fù)發(fā)相關(guān),在體外實驗中下調(diào)癌睪抗原的表達能夠改變腫瘤細胞的生物學(xué)特性,降低其粘附和侵襲轉(zhuǎn)移能力,此外癌睪抗原的表達可以作為多種惡性腫瘤不良預(yù)后的指標。在過去的研究中,一些HLA-I類分子限制的癌睪抗原肽段已被鑒定出來。同時抗原特異性T細胞在提高疾病的預(yù)后方面發(fā)揮著作用,已有報道評估了經(jīng)NY-ESO-1和MAGE-A3疫苗免疫治療過的黑色瘤患者體內(nèi)特異性T細胞的比例,T細胞的頻度和功能同患者的預(yù)后相關(guān),抗原特異性T細胞能夠明顯提高患者的緩解率并延長腫瘤患者的生存期。然而癌睪抗原的表達以及其誘發(fā)的T細胞免疫反應(yīng)在食管癌中鮮有報道,此外,抗原特異性T細胞在腫瘤部位的功能往往是受損的。腫瘤微環(huán)境中,存在很多影響T細胞發(fā)揮抗腫瘤功能的因素,如T細胞本身在活化的過程中會高表達一系列抑制性分子包括程序化死亡受體1(Programmed death-1,PD-1)和細胞毒T淋巴細胞相關(guān)抗原4(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)等,針對T細胞表面的抑制性分子已經(jīng)開發(fā)了一系列的單克隆抗體,尤其是靶向免疫檢查點PD-1/CTLA-4的治療在多種惡性腫瘤中顯示了驚人的療效,但腫瘤微環(huán)境中仍存在一些影響T細胞發(fā)揮抗腫瘤功能的因素,如腫瘤微環(huán)境中的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)能夠誘導(dǎo)T細胞的凋亡并能抑制T細胞功能的發(fā)揮,并有文獻證實腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制細胞通過產(chǎn)生活性氧而抑制T細胞的活化和功能,而應(yīng)用活性氧清除劑谷胱甘肽聯(lián)合PD-1/PD-L1的阻斷是否能夠協(xié)同抑制T細胞的凋亡和促進T細胞功能的恢復(fù)尚無報道。本研究旨在檢測癌睪抗原在食管癌腫瘤組織中的表達并分析其同臨床參數(shù)之間的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)MAGE-A3和MAGE-C2在食管癌腫瘤組織中高表達,并同不良預(yù)后相關(guān)。進一步檢測了MAGE-A3特異性CD8+T細胞在食管癌患者外周血中的比例和功能,并分析其比例和功能同食管癌臨床參數(shù)之間的相關(guān)性,證實了PD-1在低反應(yīng)性CD8+T細胞和腫瘤浸潤淋巴細胞表面高表達,PD-1+CD8+T細胞功能受損,阻斷PD-1/PD-L1通路能夠在一定程度上增加MAGE-A3特異性T細胞的增殖能力和殺傷功能。腫瘤微環(huán)境中能夠產(chǎn)生大量的活性氧,PD-1+CD8+T細胞活性氧的表達水平升高,進一步探討了活性氧清除劑谷胱甘肽聯(lián)合PD-1/PD-L1阻斷協(xié)同增強T細胞的抗腫瘤效果。第一部分癌睪抗原在食管癌腫瘤組織中的表達及其臨床意義方法1)RT-PCR檢測MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2和NY-ESO-1在食管癌腫瘤組織中的表達。2)分析癌睪抗原基因的表達同臨床參數(shù)之間的相關(guān)性。3)免疫組化分析MAGE-A3和MAGE-C2在食管癌組織中的表達并探討同預(yù)后之間的聯(lián)系。4)體外實驗探討MAGE-A3/MAGE-C2對腫瘤細胞系生物學(xué)特性的影響。結(jié)果1)癌睪抗原在正常組織中不表達,在食管癌腫瘤組織中高表達,并具有較高的陽性率。2)MAGE-A3和MAGE-C2的表達同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期相關(guān)。3)MAGE-A3陽性患者的生存期較MAGE-A3陰性患者生存期差,并能夠作為一個獨立的預(yù)后指標。4)MAGE-A3和MAGE-C2同腫瘤細胞株的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān),下調(diào)MAGE-A3/C2的表達能夠降低腫瘤細胞株的成球能力和侵襲轉(zhuǎn)移能力,并誘導(dǎo)間質(zhì)向上皮轉(zhuǎn)化。小結(jié)癌睪抗原在食管癌組織中具有較高的陽性率,MAGE-A3的表達可作為一個獨立的預(yù)后指標,通過改變腫瘤細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化影響腫瘤細胞的成球能力和侵襲轉(zhuǎn)移能力,并可以作為免疫治療潛在的靶點。第二部分MAGE-A3抗原特異性T細胞的比例和功能在食管癌患者中的臨床意義方法1)選擇HLA-A2和MAGE-A3共陽性的患者,體外培養(yǎng)MAGE-A3抗原特異性CD8+T細胞,用MAGE-A3-Tetramer(KVAELVHFL)標記腫瘤抗原特異性T細胞。2)IFN-g-ELSPOT和PI-Annexin V雙染法分別檢測了Tetramer+/CD8+T細胞對腫瘤細胞的特異性殺傷能力。3)流式檢測Tetramer+/CD8+T細胞的比例,分析MAGE-A3抗原特異性T細胞的比例和功能同臨床資料之間的相關(guān)性。結(jié)果1)MAGE-A3-Tetramer+/CD8+T細胞在外周血中比例很低(0.01%),經(jīng)負載肽段的DC刺激14d后,Tetramer+/CD8+T細胞的比例均高于0.2%以上。Tetramer+/CD8+T細胞能夠?qū)LA-A2+/MAGE-A3+食管癌細胞株產(chǎn)生特異性殺傷(MAGE-A3抗原特異性CD8+T細胞在體外具有殺傷腫瘤細胞的功能,并能夠分泌CD107a和IFN-g)。2)Tetramer+/CD8+T細胞的比例與年齡呈正相關(guān),而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期呈負相關(guān)(P0.05)。CD107a的表達水平與臨床預(yù)后不良的參數(shù)呈負相關(guān)(如:淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期和腫瘤體積)(P0.05)。3)功能性Tetramer+/CD8+T細的比例能夠提示患者的預(yù)后。小結(jié)MAGE-A3-Tetramer+/CD8+T細胞具有特異性殺傷腫瘤細胞的功能,Tetramer+/CD8+T細胞的功能可作為預(yù)測食管癌預(yù)后的指標,有功能的MAGE-A3-Tetramer+/CD8+T細胞的比例與患者的生存期呈正相關(guān)。本研究為靶向MAGE-A3抗原的疫苗治療和TCR基因修飾T細胞治療提供理論依據(jù)。第三部分PD-1在食管癌患者無反應(yīng)性T細胞表面高表達方法1)流式檢測MAGE-A3抗原特異性CD8+T細胞上PD-1的表達。2)分選CD107a+/IFN-g+和CD107a-/IFN-g-MAGE-A3抗原特異性CD8+T細胞,Real-time PCR檢測CD107a+/IFN-g+和CD107a-/IFN-g-的MAGE-A3抗原特異性CD8+T細胞PD-1的表達差異。3)流式細胞儀檢測外周血、腫瘤組織和配對正常組織浸潤淋巴細胞表面PD-1的表達,并比較了腫瘤浸潤淋巴細胞中PD-1+CD8+T細胞和PD-1-CD8+T細胞功能的差異;對比了腫瘤組織和配對正常組織中抗原遞呈細胞和上皮源性細胞表面PD-L1的表達。4)檢測了阻斷PD-1/PD-L1對MAGE-A3特異性CD8+T細胞增殖能力和功能的影響。結(jié)果1)PD-1在無反應(yīng)性MAGE-A3特異性CD8+T細胞和腫瘤浸潤淋巴細胞表面高表達。2)PD-L1在腫瘤組織中高表達,腫瘤浸潤淋巴細胞中的PD-1+CD8+T細胞功能受限。3)阻斷PD-1/PD-L1能夠在一定程度上增加MAGE-A3特異性CD8+T細胞的增殖和分泌內(nèi)因子的功能。小結(jié)食管癌患者腫瘤浸潤CD8+T淋巴細胞表面高表達PD-1,且PD-1+CD8+T細胞功能受限。通過阻斷PD-1/PD-L1能夠一定程度上增加MAGE-A3特異性CD8+T細胞的增殖能力和功能。第四部分谷胱甘肽聯(lián)合阻斷PD-1/PD-L1通路協(xié)同增強MAGE-A3抗原特異性CD8+T細胞的抗腫瘤效果方法1)檢測PD-1+/PD-1-CD8+T細胞凋亡的差異和活性氧表達的差異。2)檢測活性氧清除劑谷胱甘肽對T細胞的ROS水平、凋亡和功能的影響。3)體外檢測谷胱甘肽聯(lián)合PD-1/PD-L1阻斷對CD8+T細胞功能的影響。4)動物實驗檢測在T細胞回輸?shù)幕A(chǔ)上聯(lián)合應(yīng)用谷胱甘肽和PD-1/PD-L1阻斷對食管癌荷瘤小鼠腫瘤生長的影響。5)分離荷瘤小鼠腫瘤組織中的浸潤淋巴細胞,通過流式細胞術(shù)檢測T細胞治療組CD8+在腫瘤部位浸潤的數(shù)目和分泌內(nèi)因子的功能。結(jié)果1)PD-1+CD8+T細胞較PD-1-CD8+T細胞的ROS水平較高,且凋亡細胞比例明顯高于PD-1-CD8+T細胞。2)谷胱甘肽能夠清除CD8+T細胞的ROS,減少PD-1+CD8+T細胞的凋亡。3)谷胱甘肽聯(lián)合阻斷PD-1/PD-L1協(xié)同增強CD8+T細胞增殖能力和分泌內(nèi)因子的功能。4)在體內(nèi)試驗中,谷胱甘肽能夠協(xié)同增加阻斷PD-1/PD-L1對CD8+T細胞的抗腫瘤的功能,延緩腫瘤的生長。5)谷胱甘肽聯(lián)合PD-1/PD-L1阻斷能夠增加腫瘤部位浸潤性CD8+T細胞的絕對數(shù),同時增強其分泌內(nèi)因子的能力。小結(jié)PD-1+CD8+T細胞具有較高水平的ROS和凋亡比例。谷胱甘肽聯(lián)合PD-1/PD-L1阻斷協(xié)同減少ROS水平和細胞凋亡比例,增強CD8+T細胞增殖能力和分泌內(nèi)因子的功能。谷胱甘肽聯(lián)合PD-1/PD-L1阻斷產(chǎn)生協(xié)同的抗腫瘤作用。結(jié)論1)癌睪抗原MAGE-A3在食管癌腫瘤組織中具有較高的陽性率,MAGE-A3的表達并可以作為一個獨立評價食管癌預(yù)后的指標。2)MAGE-A3特異性CD8+T細胞能夠特異性殺傷HLA-A2+/MAGE-A3+腫瘤細胞,功能性MAGE-A3特異性CD8+T細胞的比例能夠預(yù)測食管癌的預(yù)后。3)PD-1在MAGE-A3特異性CD8+T細胞和食管癌腫瘤浸潤淋巴表面高表達,阻斷PD-1/PD-L1能夠一定程度上增加MAGE-A3特異性CD8+T細胞的比例和功能。4)谷胱甘肽聯(lián)合阻斷PD-1/PD-L1通路協(xié)同減少ROS的水平和細胞凋亡比例,增強CD8+T細胞分泌內(nèi)因子的功能。谷胱甘肽聯(lián)合PD-1/PD-L1阻斷產(chǎn)生協(xié)同的抗腫瘤作用。
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圖片說明： 圖 1.1 癌睪抗原在食管癌組織中的表達癌睪抗原基因在腫瘤組組織中的表達（代表性結(jié)果），M：marker, 1-陽性對照，2，3-10，食管癌腫瘤標本。B：四個癌睪抗原基因在食管癌腫瘤組織中的累積表達食管癌標本不表達任何一個癌睪抗原基因，15% 的標本表達一個，27% 的標本表38%的標本表達三個，13% 的標本表達四個癌睪抗原基因。C：四個癌睪抗原基例食管癌腫瘤組織中的表達情況，數(shù)字代表在 193 例食管癌標本中的陽性例數(shù)。 癌睪抗原（mRNA 水平）的表達與臨床參數(shù)之間的相關(guān)性分析為了闡明癌睪抗原 mRNA 水平的表達與食管鱗癌臨床疾病進展之間我們分析了 MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2 和 NY-ESO-1 mRNA 的床病理參數(shù)之間的關(guān)系（表 1.2）。MAGE-A3 的表達與年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)分期有相關(guān)性，在年齡<65 歲或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或腫瘤分期較晚的患者群里GE-A3 陽性率較高（P<0.05）。這些結(jié)果提示 MAGE-A3 在 mRNA 表達癌患者的疾病進展密切相關(guān)，，MAGE-A3 mRNA 水平的表達可作為預(yù)示進展的標志物。而 MAGE-C2 與腫瘤的分期正相關(guān)，分期越晚，陽性率
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圖片說明： 3.3 MAGE-A3 和 MAGE-C2（蛋白表達水平）同臨床參數(shù)之間的相關(guān)分析前期 mRNA 水平結(jié)果顯示 MAGE-A3 和 MAGE-C2 同食管癌疾病的進展一定的內(nèi)在聯(lián)系，為了進一步闡明 MAGE-A3 和 MAGE-C2 蛋白在食管鱗癌發(fā)發(fā)展中的作用，我們應(yīng)用免疫組化方法檢測了 MAGE-A3 和 MAGE-C2 蛋白水在食管癌腫瘤組織中的表達，并分析了其表達同食管鱗癌患者臨床參數(shù)之間關(guān)系（表 1.4）。結(jié)果顯示：MAGE-A3 和 MAGE-C2 在食管癌腫瘤組織中的陽率分別為 71%和 56%，同臨床資料的相關(guān)性分析結(jié)果如表 1.4 所示，MAGE和 MAGE-C2 蛋白水平的表達與食管鱗癌患者的性別和年齡無關(guān)（P>0.05），與食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期、分化程度及腫瘤浸潤深度相關(guān)（P<0.05淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期較晚的患者 MAGE-A3 和 MAGE-C2 共陽性比例較高疫組化檢測 MAGE-A3/C2 在食管癌腫瘤組織中的表達的代表性結(jié)果、陽性對和陰性對照（圖 1.2）。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.1

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