【摘要】：背景肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)為當(dāng)今世界范圍內(nèi)嚴(yán)重危害人類(lèi)生命健康安全的常見(jiàn)惡性腫瘤之一,為全球第5位常見(jiàn)腫瘤,占癌癥相關(guān)死亡的第三位。目前,肝癌治療仍以手術(shù)為主,但20-35%的肝癌患者適合手術(shù)治療,且術(shù)后復(fù)發(fā)率高,達(dá)50%。而肝動(dòng)脈化療栓塞(TACE)、局部消融治療是非手術(shù)切除原發(fā)性肝癌的首先治療,但因治療的不沏底性,其療效也不盡如人意。索拉非尼靶向治療、FOLFOX4方案化療是目前中晚期肝癌全身治療一線(xiàn)選擇,但延長(zhǎng)生存期有限。因此,尋找有效治療肝癌的新途徑是目前腫瘤醫(yī)學(xué)界所面臨的巨大困難和挑戰(zhàn)。Bcl-2、Bcl-xL以及Bcl-w是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)Bcl-2抗凋亡蛋白家族中的重要成員。他們共同包含BH1、BH2、BH3和BH4等4個(gè)BH結(jié)構(gòu)域。據(jù)報(bào)道,Bcl-2抗凋亡蛋白能抑制線(xiàn)粒體外膜滲透性,從而抑制應(yīng)激誘導(dǎo)下細(xì)胞凋亡。多種腫瘤組織中常出現(xiàn)Bcl-2抗凋亡蛋白異常表達(dá),同時(shí),常伴隨著相關(guān)的治療耐藥。先前研究發(fā)現(xiàn),Bcl-2抗凋亡蛋白的表達(dá)水平與與肝癌的臨床病理分級(jí)以及患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。因此,抗Bcl-2抗凋亡蛋白靶向藥物治療有望成為治療肝癌的重要手段之一。ABT-737是由美國(guó)Abbot實(shí)驗(yàn)室所研發(fā)的一種小分子Bcl-2、Bcl-xL以及Bcl-w抑制劑,目前,ABT-737正進(jìn)行白血病患者的I期臨床研究。前期也有報(bào)道,ABT-737能抑制多種肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)。然而,ABT-737在治療肝癌細(xì)胞時(shí)常會(huì)同時(shí)激活其他抗凋亡信號(hào)通路,從而減弱ABT-737抗腫瘤效應(yīng)。因此,需尋找新的治療策略來(lái)改善ABT-737抗腫瘤效應(yīng)。姜黃素(curcumin)是從中藥姜黃中提取得到的天然色素成分。目前大量研究證實(shí),姜黃素對(duì)多種惡性腫瘤具有抗瘤效應(yīng),包括肝癌。多個(gè)前期研究表明,姜黃素能有效抑制體內(nèi)外肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。而且,姜黃素能明顯增強(qiáng)常規(guī)化療和靶向藥物的抗瘤效應(yīng)。但是,姜黃素和ABT-737之間是否存在協(xié)同效應(yīng),目前仍未闡述。目的本實(shí)驗(yàn)對(duì)姜黃素是否具有增強(qiáng)ABT-737抗HepG2肝癌細(xì)胞增殖作用進(jìn)行研究,同時(shí),也對(duì)姜黃素是否通過(guò)誘導(dǎo)凋亡增強(qiáng)ABT-737抗HepG2肝癌細(xì)胞效應(yīng)進(jìn)行研究,進(jìn)一步,對(duì)姜黃素是否通過(guò)ROS-ASK1-JNK氧化還原信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路途徑增強(qiáng)ABT-737誘導(dǎo)HepG2肝癌細(xì)胞凋亡進(jìn)行探索。我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)初步對(duì)姜黃素增強(qiáng)ABT-737對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)及其可能機(jī)制進(jìn)行探索,旨在為ABT-737以及姜黃素的進(jìn)一步應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)以及參考。方法(1)將人肝癌細(xì)胞HEPG2隨機(jī)分為3大組：①ABT-737濃度梯度組：分別用0μM、1μM、5μM、10 μM、15μM濃度梯度作用于HEPG2細(xì)胞；②姜黃素濃度梯度組：分別用0μM、2μM、4μM、6μM、8μM濃度梯度作用于HEPG2細(xì)胞；③聯(lián)合用藥組：選取姜黃素影響最小的濃度分別與0μM、1μN(yùn)、5μM、 10 μABT-737聯(lián)合作用于HEPG2細(xì)胞。用臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各藥物作用組中人肝癌細(xì)胞HEPG2的死亡率；CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各藥物作用組中人肝癌細(xì)胞HEPG2的增殖活性。(2)將人肝癌細(xì)胞HEPG2隨機(jī)分為3組,即①1%DMSO溶劑對(duì)照組；②單用藥組：ABT-73710μM組和姜黃素2μM組；③聯(lián)合用藥組：ABT-73710μM+姜黃素2μM組。Hoechst 33258染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞的Caspase-3活性；western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中Bcl-2, Mcl-1、PARP、C-PARP、C-easpase-3蛋白的表達(dá)；活性氧檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞中ROS水平。(3)將人肝癌細(xì)胞HEPG2隨機(jī)分為3大組：第一組分為10μM ABT-737+2 μM姜黃素組和10μM ABT-737+2μM姜黃素+10μN(yùn)AC組(ROS抑制劑)；第二組分為10μM ABT-737+2μM姜黃素組和10μM ABT-737+2μM姜黃素±SP600125組(JNK抑制劑)；第三組分為對(duì)照組,即轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體,隨后用10μM ABT-737+2μM姜黃素處理細(xì)胞和ASK1 siRNA組,即轉(zhuǎn)染ASK1 siRNA,隨后用10μM ABT-737+2μM姜黃素處理細(xì)胞。分別用Hoeehst 33258染色實(shí)驗(yàn)、Annexin V-FITC/PI雙染色法以及Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)第一組細(xì)胞中細(xì)胞凋亡以及Caspase-3活性的變化。western blot法分別檢測(cè)I%DMSO溶劑對(duì)照組、2μM姜黃素、10μM ABT-737和10μM ABT-737+2 μM姜黃素組中p-JNK1和p-JNK2, JNK1和JNK2的表達(dá)；隨后檢測(cè)第一組細(xì)胞中p-JNK1和p-JNK2,JNK1和JNK2的表達(dá)。Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測(cè)第二組細(xì)胞的凋亡情況。臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)第三組細(xì)胞的死亡情況。結(jié)果(1)ABT-737和姜黃素均對(duì)人肝癌HEPG2細(xì)胞活力具有明顯抑制作用,且呈劑量依賴(lài)性(F=594.692, P=.000) , (F=422.147, P=.000); ABT-737和姜黃素均對(duì)人肝癌HEPG2細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用,且呈劑量依賴(lài)性(F=1127.812, P=.000) , (F=1539.563, P=,000)。為排除實(shí)驗(yàn)干擾,我們選擇對(duì)HEPG2細(xì)胞無(wú)顯著影響的姜黃素濃度,即2μM進(jìn)行實(shí)驗(yàn),當(dāng)不同濃度梯度ABT-737分別與2μM姜黃素配伍使用對(duì)人肝癌HEPG2細(xì)胞活力的抑制率以及細(xì)胞死亡率顯著高于ABT-737相應(yīng)濃度單用時(shí),且當(dāng)10μM ABT 737與2 gM姜黃素配伍時(shí)對(duì)HRPG2細(xì)胞活力的抑制率和死亡率最高,且呈劑量依賴(lài)性(F=799.555, P=.000) , (F=1372.177, P=.000)。(2) Hoechst 33258實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,10μM ABT-737+2μM姜黃素組細(xì)胞的.凋亡數(shù)量顯著高于單用2μM姜黃素組或單用10μM ABT-737組。Caspase-3活性檢測(cè)結(jié)果顯示2μM姜黃素組中細(xì)胞的caspase-3活性無(wú)顯著變化,10μM ABT-737組中細(xì)胞的caspase-3活性稍增高,10μM ABT-737+2μM姜黃素組與10μM ABT-737組相比easpase-3活性顯著增高(2.250±0.132, 1.524±0.086, F=251.578, P=.000) o Western blot結(jié)果表明10μM ABT-737+2μM姜黃素組中C-caspase-3蛋白的含量較10μM ABT-737組顯著增高(0.8414-0.055,0.5444-0.047, F=88.286, P=.000)。ROS檢測(cè)結(jié)果表明,10μM ABT-737+2μM姜黃素組較10μM ABT-737組的ROS水平顯著增高(2.257±0.088,1.231±0.068,F=566.789,P=.000)。(3)當(dāng)加入NAC (ROS抑制劑)后,10μM ABT-737+2μM姜黃素對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用顯著降低(26.417±2.714,15.540±1.587,t=14.640,P=.000),Caspase-3活性亦顯著下降(2.276±0.025,1.518±0.053,t=38.688,P=.000)。western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,2μM姜黃素+10μM ATB-737較10μl ABT-737組更易使JNK蛋白活化(0.914±0.043,0.714±0.034, F=134.864, P=000; 0.907±0.078, 0.710±0.039, F=71.176, P=.002)當(dāng)加入NAC后,2μM姜黃素+10μM ATB-737作用下細(xì)胞中活化的JNK蛋白表達(dá)量顯著降低(0.717±0.093, 0.924±0.079, t=2.942, P=0.042;0.767±0.078, 0.918±0.039, t=4.121, P=0.015)。Armexin V-FITC/PI雙染色法結(jié)果表明,當(dāng)加入SP600125 (JNK抑制劑)后2μM姜黃素+10μtM ATB-737作用下細(xì)胞的凋亡數(shù)量顯著減少(25.326±2.122,14.450±1.625,t=14.983,P=.000)。當(dāng)沉默細(xì)胞中ASK1后,2μM姜黃素+10μM ATB-737作用下細(xì)胞的死亡率顯著降低(39.050±5.930,26.657±3.104,t=18.578,P=.000)。結(jié)論姜黃素能夠通過(guò)上調(diào)ROS水平,進(jìn)而通過(guò)激活ROS-ASKI-JNK信號(hào)通路增效ABT-737誘導(dǎo)HEPG2細(xì)胞凋亡的作用。
文內(nèi)圖片：
圖片說(shuō)明：圖２－２各藥物處理組ＨＥＰＧ２細(xì)胞的ｃａｓｐａｓｅ－３活性檢測(cè)結(jié)果逡逑
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R735.7

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 鄭銳年;姜黃素經(jīng)由活化ROS-ASK1-JNK通路增效ABT-737誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡作用機(jī)制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

，

本文編號(hào)：2511733