【摘要】：小分子非編碼RNA(small non-coding RNA), 主要包括 tRNA.snRNA. snoRNA.microRNA(miRNA).siRNA和Piwi-interacting RNA(piRNA)等非編碼蛋白質的RNA分子。隨著對RNA研究的深入,小分子非編碼RNA的研究也日益引起大家的注意和重視,現(xiàn)在已知道它們在基因的轉錄、轉錄后調控以及引導染色質修飾復合物中起到了重要的作用。piRNA是從哺乳動物生殖細胞中分離得到的一類長度約為26-31nt的小分子非編碼RNA,并且與PIWI蛋白家族成員相結合。目前,盡管已經(jīng)知道piRNA在精子形成中起著重要的作用,但在男性的精漿中的分布情況尚不完全清晰。在本研究第一節(jié)的第一部分中,我們系統(tǒng)地檢測男性不育患者和正常對照的精漿中的piRNA差異表達譜,篩選出在不育男性患者中存在表達差異的piRNA.我們一共收集了91例正常對照和211例男性不育患者的精漿樣本。選取正常對照17例、弱精癥患者24例和無精癥患者21例分別混合后提取RNA,然后通過高通量測序技術對RNA進行測序,初步篩選到有61個piRNA在不育患者組和正常對照組之間存在明顯地表達差異,然后我們對每一個樣本中piRNA進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術檢測,先使用少量樣本量(包括正常對照16例、弱精癥患者20例和無精癥患者20例)對初篩出61個piRNA進行復篩,復篩結果顯示有4種piRNA(piR-31068,piR-31925,piR-43771和piR-43773)在弱精癥患者精漿中顯著降低；有5種piRNA(iR-31068,piR-31925,piR-43771,piR-43773和piR-30198)在無精組患者精漿中顯著降低。然后使用大量樣本(包括正常對照58例、弱精癥患者74例和無精癥患者52例)對復篩出的piRNA進行驗證,結果和復篩結果變化趨勢一致。在整個過程中我們使用對應piRN A的人工合成標準品構建標準曲線,所以計算出了piRNA的絕對濃度,同時我們使用ROC曲線分析及Risk_score分析顯示該5種piRNA的確能夠區(qū)分出正常對照與不育患者。在本研究第一節(jié)第二部分中,我們也通過高通量測序技術對正常對照和弱精癥患者精子中的piRNA進行測序,結果顯示在弱精癥患者精子中piRNA的含量和種類明顯減少。精子中蛋白檢測發(fā)現(xiàn)MitoPLD在弱精癥患者的表達量明顯下降,這種差異極有可能影響精子中piRNA的形成。通過電鏡檢測發(fā)現(xiàn)精漿中存在大量的Exosome,并發(fā)現(xiàn)精漿piRNA大部分存在于Exosome中。miRNA是一類長度約為21 nt的小分子非編碼RNA,大量研究表明,miRNA參與調控～30%人類基因,涉及到很多生理過程,包括器官發(fā)育、細胞分化、細胞周期和細胞凋亡等,還有1miRNA在癌癥的發(fā)生和進程中扮演了一個重要的調控者,其中也包括乳腺癌。本研究第二節(jié)主要研究miR-96在乳腺癌中的表達情況及在乳腺癌發(fā)生過程中所起的生物學功能。本實驗通過臨床樣本發(fā)現(xiàn)miR-96在乳腺癌樣本中表達量上升,體外實驗顯示miR-96促進細胞的增殖、遷移和侵襲,動物實驗發(fā)現(xiàn)miR-96促進腫瘤的生長。我們通過生物信息學預測及實驗驗證miR-96是通過靶向PTPN9蛋白來促進乳腺癌癥的發(fā)生及發(fā)展,然后我們在乳腺癌細胞中通過下調或上調PTPN9蛋白的表達量,結果顯示PTPN9的生物學功能與miR-96的生物學功能成負相關,這也說明miR-96是通過抑制PTPN9蛋白來行使生物學功能。本實驗顯示了miR-96在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色及通過靶向PTPN9蛋白來發(fā)揮生物學功能,同時也為乳腺癌的發(fā)生提供了新的分子生物學機制。
[Abstract]:Small-molecule non-coding RNA, mainly including tRNA. snRNA. SnRNA. microRNA (miRNA). RNA molecules of non-coding proteins such as siRNA and Piwi-intting RNA (piRNA). As the research of RNA is in-depth, the research of small-molecule non-coding RNA has also attracted attention and attention, and it is now known that they play an important role in the transcription, post-transcriptional regulation and the guiding of chromatin modification complexes. The piRNA is a class of small-molecular, non-coding RNAs, isolated from the mammalian germ cells, of a length of about 26-31nt, and is combined with the PIWI protein family member. At present, although it is known that the piRNA plays an important role in the formation of spermatogenesis, the distribution of piRNA in the seminal plasma of the male is not completely clear. In the first part of the first section of this study, we systematically examined the difference expression profile of the piRNA in the seminal plasma of the male sterile patient and the normal control, and screened a piece of piRNA expressing the difference in the male sterile male. We collected a total of 91 normal controls and 211 male sterile patients with seminal plasma samples. The RNA was extracted from 21 patients with normal control and 21 of the patients with azoospermia, and then the RNA was sequenced by high-throughput sequencing, and there were 61 pieces of piRNA clearly expressed in the sterile patient group and the normal control group. Then we used the real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR) technology to detect the piRNA in each sample, using a small amount of sample size (including 16 normal controls,20 patients with hypospermia and 20 patients with azoospermia) to screen out 61 pieces of piRNA from the primary screen, and the result of the re-screening showed that there were 4 pieces of piRNA (piR-31068, piR-31925, Pir-43771 and pir-43773) were significantly reduced in the seminal plasma of patients with asthenospermia;5 pieces of piRNA (iR-31068, piR-31925, piR-43771, piR-43773, and piR-30198) were significantly reduced in the seminal plasma of the unrefined group. The double-screened piRNA was then validated using a large number of samples (including 58 normal controls,74 patients with hypospermia and 52 patients with azoospermia) and the results were consistent with the results of the re-screening. In the whole process, we used the synthetic standard of piRNA to construct the standard curve, so the absolute concentration of piRNA was calculated. At the same time, we used the ROC curve analysis and the Risk _ score analysis to show that the five pieces of piRNA do distinguish between the normal control and the sterile patient. In the second part of the first part of this study, we also sequenced the pieces of piRNA in the sperm of the normal control and the asthenospermia by the high-throughput sequencing technique, and the results showed that the content and type of piRNA in the sperm of the patients with asthenospermia were significantly reduced. The detection of the protein in the sperm showed that the expression of the MitePLD in the patients with asthenospermia was significantly reduced, and the difference was highly likely to affect the formation of piRNA in the sperm. A large number of Exosomes were found in the seminal plasma by electron microscopy, and most of the piRNA was found to be present in the Exosome. MiRNA is a small molecule non-coding RNA with a length of about 21 nt, and a large number of studies have shown that the miRNA is involved in regulating the human gene of -30%, and relates to many physiological processes, including organ development, cell differentiation, cell cycle and cell apoptosis. There are also 1 miRNAs that play an important regulator in the occurrence and progression of cancer, including breast cancer. The second section of this study mainly studies the expression of miR-96 in breast cancer and its biological function in the process of breast cancer. In this experiment, the expression of miR-96 in the sample of breast cancer was increased by clinical samples, and the in vitro experiment showed that miR-96 promoted the proliferation, migration and invasion of the cells, and the animal experiment found that the miR-96 promoted the growth of the tumor. The biological function of the PTPN9 is negatively correlated with the biological function of the miR-96 by means of the bioinformatics prediction and the experiment to verify the occurrence and development of the breast cancer by targeting the PTPN9 protein, and then, the expression level of the PTPN9 protein is reduced or increased in the breast cancer cell, and the result shows that the biological function of the PTPN9 is inversely related to the biological function of the miR-96, This also indicates that miR-96 is a biological function by inhibiting the PTPN9 protein. The experiment shows that miR-96 plays an important role in the development of breast cancer and plays a biological function by targeting the PTPN9 protein, and also provides a new molecular biological mechanism for the occurrence of breast cancer.
【學位授予單位】：南京大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9;R698.2

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本文編號：2509308