【摘要】：近年來肺癌的發(fā)病率與死亡率迅速上升,嚴重威脅人類的生命健康。小細胞肺癌約占肺癌的20%,其惡性程度高、生長迅速、轉移快、對化療和放療敏感,初治緩解率高,但極易發(fā)生繼發(fā)性耐藥和放療抵抗、預后差。隨著立體定向放射外科、放射治療設備和技術的飛速發(fā)展,放射治療為肺癌患者提供了非常有效的治療手段。然而,腫瘤細胞在放射治療中后期往往產生不同程度的輻射耐受性,從而降低了放射治療預期的療效。mi RNA是一種內源性非編碼小分子RNA,在腫瘤的形成、增殖、凋亡、化療耐藥以及放療抵抗中起著重要的作用,因此,miRNA的研究對腫瘤的診斷及治療具有重大意義。miRNA-22是一種腫瘤抑制因子,miRNA-22高表達能夠顯著抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲。本研究的目的在于探究mi R-22對小細胞肺癌細胞系NCI-H446放療敏感性的影響,并進一步挖掘相關的分子機制,為改善小細胞肺癌的放射治療效果提供新思路。主要研究內容如下:1.RT-qPCR檢測miR-22在人正常肺上皮細胞系BEAS-2B和小細胞肺癌細胞系NCI-H446中的mRNA表達水平。結果表明,miR-22在小細胞肺癌細胞系NCI-H446的表達顯著降低。2.利用miR-22模擬物(mimics)及其對照(nc),瞬時轉染小細胞肺癌細胞系NCI-H446,建立miR-22過表達的細胞系。利用mi R-22抑制物(inhibitors)及其對照(inhibitors nc),瞬時轉染小細胞肺癌細胞系NCI-H446,建立mi R-22敲低的細胞系。選擇載體pLKO.1構建miR-22過表達質粒,采用慢病毒轉染的方法,將成功構建的重組質粒及其空載質粒分別轉染小細胞肺癌細胞系NCI-H446,建立miR-22過表達的穩(wěn)轉株。利用RT-qPCR技術分別檢測陽性細胞株,結果與預期相符,表明miR-22過表達和敲低的細胞系以及miR-22過表達穩(wěn)轉株構建成功。3.采用0Gy、2Gy、4Gy的γ射線照射miR-22不同表達水平的小細胞肺癌細胞NCI-H446,通過MTS實驗、集落形成實驗和Ki-67抗體檢測miR-22對小細胞肺癌細胞增殖的影響。結果表明,在γ射線不同劑量照射條件下,miR-22過表達顯著抑制細胞增殖,而miR-22敲低顯著促進細胞增殖,并且隨著照射劑量的增加趨勢更加明顯。采用APC Annexin V/PI雙染法,并借助流式細胞儀檢測miR-22對小細胞肺癌細胞凋亡的影響。結果表明,miR-22過表達能夠顯著促進細胞凋亡。利用碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色,并借助流式細胞儀進行細胞周期實驗,發(fā)現(xiàn)miR-22對小細胞肺癌細胞NCI-H446的周期幾乎無影響。利用劃痕實驗檢測細胞遷移,發(fā)現(xiàn)miR-22過表達能夠顯著抑制小細胞肺癌細胞NCI-H446的遷移能力。4.通過生物信息學數據庫Target Scan和Pictar預測miR-22的靶基因,尋找共同的預測靶基因,通過NCBI搜索和文獻檢索,選擇與DNA損傷修復相關的基因WRNIP1進行驗證。采用RT-qPCR、Western blot和雙熒光素酶報告基因實驗,驗證WRNIP1與mi R-22的靶向關系。結果表明,WRNIP1是miR-22的直接靶基因,miR-22對WRNIP1具有負向調控作用。5.選擇miR-22過表達的穩(wěn)轉株及其空載對照進行高通量轉錄組測序,尋找與細胞增殖、遷移和凋亡相關的差異表達基因(KLK8、PC、SCUBE1、STC1和GPM6A),進行RT-qPCR驗證。結果顯示,在miR-22過表達穩(wěn)轉株中,KLK8表達下調,其它四個基因均表達上調,符合理論預期。因此,推測miR-22抑制NCI-H446細胞增殖和遷移可能與KLK8、PC和SCUBE1基因相關,miR-22促進NCI-H446細胞凋亡可能與STC1和GPM6A基因相關。初步闡釋了miR-22增加小細胞肺癌放療敏感性的分子機制。
[Abstract]:In recent years, the incidence and mortality of lung cancer have risen rapidly, which is a serious threat to the health of human life. The small-cell lung cancer accounts for 20% of the lung cancer, the malignant degree of the small-cell lung cancer is high, the growth is rapid, the transfer is fast, the chemotherapy and the radiotherapy are sensitive, the initial treatment response rate is high, the secondary drug resistance and the radiotherapy resistance are easy to occur, and the prognosis is poor. With the rapid development of stereotactic radiosurgery, radiotherapy equipment and technology, radiation therapy provides a very effective means of treatment for patients with lung cancer. However, the tumor cells tend to produce different degrees of radiation resistance in the middle and later stages of radiation therapy, thus reducing the expected therapeutic effect of radiation therapy. Mi-RNA is an endogenous non-coding small-molecule RNA, plays an important role in the formation, proliferation, apoptosis, chemotherapy resistance and radiotherapy resistance of the tumor, and therefore, the research of miRNA is of great significance to the diagnosis and treatment of the tumor. MiRNA-22 is a tumor suppressor, and the high expression of miRNA-22 can significantly inhibit the proliferation and invasion of tumor cells. The purpose of this study was to explore the effect of mi R-22 on the sensitivity of NCI-H446 radiotherapy for small cell lung cancer cell lines, and to further explore relevant molecular mechanisms to provide a new way to improve the therapeutic effect of small cell lung cancer. The main contents of this study are as follows:1. RT-qPCR is used to detect the mRNA expression level of miR-22 in human normal lung epithelial cell line (BEAS-2B) and small-cell lung cancer cell line (NCI-H446). The results showed that the expression of miR-22 in small cell lung cancer cell line NCI-H446 was significantly decreased. The miR-22 mimetics and its control (nc) were used to transiently transfect the small cell lung cancer cell line NCI-H446 to establish a miR-22 overexpression cell line. Small cell lung cancer cell line NCI-H446 was transiently transfected with the mi R-22 inhibitor and its controls, and a cell line with a low mi R-22 was established. The expression plasmid of miR-22 was constructed by selection of vector pLKO.1, and the recombinant plasmid and its no-load plasmid were transfected into small-cell lung cancer cell line NCI-H446, respectively, and the expression of miR-22 was established. The positive cell line was detected by RT-qPCR. The results showed that the expression of miR-22 and the knockdown of the cell line and the expression of miR-22 were successful. The effects of miR-22 on the proliferation of small-cell lung cancer cells were detected by MTS assay, colony formation assay and Ki-67 antibody. The results showed that the expression of miR-22 significantly inhibited the proliferation of the cells under different doses of X-ray, and the knockdown of miR-22 significantly promoted the cell proliferation, and the trend of the increase of the irradiation dose was more obvious. The effect of miR-22 on the apoptosis of small cell lung cancer cells was detected by using the APC Annexin V/ PI double staining method. The results show that the overexpression of miR-22 can promote the apoptosis of cells. It was found that miR-22 had little effect on the cycle of NCI-H446 in small-cell lung cancer cells by using propidium iodide (PI) and cell cycle experiment by flow cytometry. Using the scratch test to detect cell migration, it was found that the overexpression of miR-22 could significantly inhibit the migration of small-cell lung cancer cells NCI-H446. The target gene of miR-22 was predicted by Bioinformatics database Target Scan and Pictar, and a common predicted target gene was found, and a gene WRNIP1 associated with DNA damage repair was selected by NCBI search and literature search. The targeting relationship between WRNIP1 and mi R-22 was verified by RT-qPCR, Western blot and double-luciferase reporter gene. The results show that WRNIP1 is a direct target gene of miR-22, and miR-22 has a negative control effect on WRNIP1. A high-throughput transcriptome sequencing was performed on a stable and no-load control of miR-22 overexpression to find differential expression genes associated with cell proliferation, migration and apoptosis (KLK8, PC, SCUBE1, STC1, and GM6A) for RT-qPCR validation. The results showed that the expression of KLK8 was down-regulated in the expression of miR-22 and the expression of KLK8 was up-regulated and the expression of KLK8 was up-regulated. Therefore, it is presumed that miR-22 inhibits the proliferation and migration of NCI-H446 cells and may be related to KLK8, PC and SCUBE1 genes, and miR-22 promotes the apoptosis of NCI-H446 cells, which may be related to the STC1 and GM6A genes. The molecular mechanism of the sensitivity of miR-22 to the radiotherapy sensitivity of small cell lung cancer is explained.
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2

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