發(fā)布時(shí)間：2019-06-28 12:23

【摘要】：近年來肺癌的發(fā)病率與死亡率迅速上升,嚴(yán)重威脅人類的生命健康。小細(xì)胞肺癌約占肺癌的20%,其惡性程度高、生長迅速、轉(zhuǎn)移快、對(duì)化療和放療敏感,初治緩解率高,但極易發(fā)生繼發(fā)性耐藥和放療抵抗、預(yù)后差。隨著立體定向放射外科、放射治療設(shè)備和技術(shù)的飛速發(fā)展,放射治療為肺癌患者提供了非常有效的治療手段。然而,腫瘤細(xì)胞在放射治療中后期往往產(chǎn)生不同程度的輻射耐受性,從而降低了放射治療預(yù)期的療效。mi RNA是一種內(nèi)源性非編碼小分子RNA,在腫瘤的形成、增殖、凋亡、化療耐藥以及放療抵抗中起著重要的作用,因此,miRNA的研究對(duì)腫瘤的診斷及治療具有重大意義。miRNA-22是一種腫瘤抑制因子,miRNA-22高表達(dá)能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。本研究的目的在于探究mi R-22對(duì)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H446放療敏感性的影響,并進(jìn)一步挖掘相關(guān)的分子機(jī)制,為改善小細(xì)胞肺癌的放射治療效果提供新思路。主要研究內(nèi)容如下:1.RT-qPCR檢測miR-22在人正常肺上皮細(xì)胞系BEAS-2B和小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H446中的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果表明,miR-22在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H446的表達(dá)顯著降低。2.利用miR-22模擬物(mimics)及其對(duì)照(nc),瞬時(shí)轉(zhuǎn)染小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H446,建立miR-22過表達(dá)的細(xì)胞系。利用mi R-22抑制物(inhibitors)及其對(duì)照(inhibitors nc),瞬時(shí)轉(zhuǎn)染小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H446,建立mi R-22敲低的細(xì)胞系。選擇載體pLKO.1構(gòu)建miR-22過表達(dá)質(zhì)粒,采用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法,將成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒及其空載質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H446,建立miR-22過表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)株。利用RT-qPCR技術(shù)分別檢測陽性細(xì)胞株,結(jié)果與預(yù)期相符,表明miR-22過表達(dá)和敲低的細(xì)胞系以及miR-22過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建成功。3.采用0Gy、2Gy、4Gy的γ射線照射miR-22不同表達(dá)水平的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H446,通過MTS實(shí)驗(yàn)、集落形成實(shí)驗(yàn)和Ki-67抗體檢測miR-22對(duì)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明,在γ射線不同劑量照射條件下,miR-22過表達(dá)顯著抑制細(xì)胞增殖,而miR-22敲低顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖,并且隨著照射劑量的增加趨勢更加明顯。采用APC Annexin V/PI雙染法,并借助流式細(xì)胞儀檢測miR-22對(duì)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明,miR-22過表達(dá)能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡。利用碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色,并借助流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)miR-22對(duì)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H446的周期幾乎無影響。利用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移,發(fā)現(xiàn)miR-22過表達(dá)能夠顯著抑制小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H446的遷移能力。4.通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫Target Scan和Pictar預(yù)測miR-22的靶基因,尋找共同的預(yù)測靶基因,通過NCBI搜索和文獻(xiàn)檢索,選擇與DNA損傷修復(fù)相關(guān)的基因WRNIP1進(jìn)行驗(yàn)證。采用RT-qPCR、Western blot和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn),驗(yàn)證WRNIP1與mi R-22的靶向關(guān)系。結(jié)果表明,WRNIP1是miR-22的直接靶基因,miR-22對(duì)WRNIP1具有負(fù)向調(diào)控作用。5.選擇miR-22過表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)株及其空載對(duì)照進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測序,尋找與細(xì)胞增殖、遷移和凋亡相關(guān)的差異表達(dá)基因(KLK8、PC、SCUBE1、STC1和GPM6A),進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證。結(jié)果顯示,在miR-22過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株中,KLK8表達(dá)下調(diào),其它四個(gè)基因均表達(dá)上調(diào),符合理論預(yù)期。因此,推測miR-22抑制NCI-H446細(xì)胞增殖和遷移可能與KLK8、PC和SCUBE1基因相關(guān),miR-22促進(jìn)NCI-H446細(xì)胞凋亡可能與STC1和GPM6A基因相關(guān)。初步闡釋了miR-22增加小細(xì)胞肺癌放療敏感性的分子機(jī)制。
[Abstract]:In recent years, the incidence and mortality of lung cancer have risen rapidly, which is a serious threat to the health of human life. The small-cell lung cancer accounts for 20% of the lung cancer, the malignant degree of the small-cell lung cancer is high, the growth is rapid, the transfer is fast, the chemotherapy and the radiotherapy are sensitive, the initial treatment response rate is high, the secondary drug resistance and the radiotherapy resistance are easy to occur, and the prognosis is poor. With the rapid development of stereotactic radiosurgery, radiotherapy equipment and technology, radiation therapy provides a very effective means of treatment for patients with lung cancer. However, the tumor cells tend to produce different degrees of radiation resistance in the middle and later stages of radiation therapy, thus reducing the expected therapeutic effect of radiation therapy. Mi-RNA is an endogenous non-coding small-molecule RNA, plays an important role in the formation, proliferation, apoptosis, chemotherapy resistance and radiotherapy resistance of the tumor, and therefore, the research of miRNA is of great significance to the diagnosis and treatment of the tumor. MiRNA-22 is a tumor suppressor, and the high expression of miRNA-22 can significantly inhibit the proliferation and invasion of tumor cells. The purpose of this study was to explore the effect of mi R-22 on the sensitivity of NCI-H446 radiotherapy for small cell lung cancer cell lines, and to further explore relevant molecular mechanisms to provide a new way to improve the therapeutic effect of small cell lung cancer. The main contents of this study are as follows:1. RT-qPCR is used to detect the mRNA expression level of miR-22 in human normal lung epithelial cell line (BEAS-2B) and small-cell lung cancer cell line (NCI-H446). The results showed that the expression of miR-22 in small cell lung cancer cell line NCI-H446 was significantly decreased. The miR-22 mimetics and its control (nc) were used to transiently transfect the small cell lung cancer cell line NCI-H446 to establish a miR-22 overexpression cell line. Small cell lung cancer cell line NCI-H446 was transiently transfected with the mi R-22 inhibitor and its controls, and a cell line with a low mi R-22 was established. The expression plasmid of miR-22 was constructed by selection of vector pLKO.1, and the recombinant plasmid and its no-load plasmid were transfected into small-cell lung cancer cell line NCI-H446, respectively, and the expression of miR-22 was established. The positive cell line was detected by RT-qPCR. The results showed that the expression of miR-22 and the knockdown of the cell line and the expression of miR-22 were successful. The effects of miR-22 on the proliferation of small-cell lung cancer cells were detected by MTS assay, colony formation assay and Ki-67 antibody. The results showed that the expression of miR-22 significantly inhibited the proliferation of the cells under different doses of X-ray, and the knockdown of miR-22 significantly promoted the cell proliferation, and the trend of the increase of the irradiation dose was more obvious. The effect of miR-22 on the apoptosis of small cell lung cancer cells was detected by using the APC Annexin V/ PI double staining method. The results show that the overexpression of miR-22 can promote the apoptosis of cells. It was found that miR-22 had little effect on the cycle of NCI-H446 in small-cell lung cancer cells by using propidium iodide (PI) and cell cycle experiment by flow cytometry. Using the scratch test to detect cell migration, it was found that the overexpression of miR-22 could significantly inhibit the migration of small-cell lung cancer cells NCI-H446. The target gene of miR-22 was predicted by Bioinformatics database Target Scan and Pictar, and a common predicted target gene was found, and a gene WRNIP1 associated with DNA damage repair was selected by NCBI search and literature search. The targeting relationship between WRNIP1 and mi R-22 was verified by RT-qPCR, Western blot and double-luciferase reporter gene. The results show that WRNIP1 is a direct target gene of miR-22, and miR-22 has a negative control effect on WRNIP1. A high-throughput transcriptome sequencing was performed on a stable and no-load control of miR-22 overexpression to find differential expression genes associated with cell proliferation, migration and apoptosis (KLK8, PC, SCUBE1, STC1, and GM6A) for RT-qPCR validation. The results showed that the expression of KLK8 was down-regulated in the expression of miR-22 and the expression of KLK8 was up-regulated and the expression of KLK8 was up-regulated. Therefore, it is presumed that miR-22 inhibits the proliferation and migration of NCI-H446 cells and may be related to KLK8, PC and SCUBE1 genes, and miR-22 promotes the apoptosis of NCI-H446 cells, which may be related to the STC1 and GM6A genes. The molecular mechanism of the sensitivity of miR-22 to the radiotherapy sensitivity of small cell lung cancer is explained.
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R734.2

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 楊元明,王全林;小細(xì)胞肺癌的外科治療[J];河南外科學(xué)雜志;2000年01期

2 金炳文,趙蘭,周彩存,李德仁,徐建芳;神經(jīng)元特異性烯醇化酶檢測在小細(xì)胞肺癌預(yù)后中的價(jià)值[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2001年12期

3 王云杰,趙正源,劉錕;小細(xì)胞肺癌治療的回顧與展望[J];陜西腫瘤醫(yī)學(xué);2001年03期

4 李勇 ,黃瑞文;小兒小細(xì)胞肺癌1例[J];臨床腫瘤學(xué)雜志;2002年01期

5 周濤 ,劉素勤 ,劉基巍;小細(xì)胞肺癌脊髓及馬尾轉(zhuǎn)移1例[J];臨床腫瘤學(xué)雜志;2002年01期

6 徐長明 ,劉長軍 ,袁繼彬;12例小細(xì)胞肺癌早期X線表現(xiàn)[J];現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生;2002年03期

7 宋元龍,李高峰,巫正偉;76例小細(xì)胞肺癌綜合治療分析[J];云南醫(yī)藥;2002年04期

8 羅文軍,殷富春,郭偉;小細(xì)胞肺癌誤診1例報(bào)告[J];實(shí)用放射學(xué)雜志;2003年12期

9 歐陽瑤 ,鄧飛 ,劉華慶;小細(xì)胞肺癌中血小板衍生生長因子的表達(dá)及意義[J];貴州醫(yī)藥;2003年01期

10 張毅,顧艷斐,鄧立宏,楊聲,李世業(yè);小細(xì)胞肺癌508例不同治療方式的綜合評(píng)價(jià)[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2004年11期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 王潔;;小細(xì)胞肺癌規(guī)范化治療及其最新進(jìn)展[A];第三屆中國腫瘤內(nèi)科大會(huì)教育集暨論文集[C];2009年

2 王華慶;李蘭芳;;小細(xì)胞肺癌的內(nèi)科治療及進(jìn)展[A];第三屆中國腫瘤學(xué)術(shù)大會(huì)教育論文集[C];2004年

3 尹秋霞;;神經(jīng)元特異性烯醇化酶測定對(duì)小細(xì)胞肺癌的診斷價(jià)值[A];中國免疫學(xué)會(huì)第五屆全國代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要[C];2006年

4 傅小龍;;小細(xì)胞肺癌治療的共識(shí)和爭議[A];2007第六屆全國放射腫瘤學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2007年

5 吳殷;曲亞偉;陳宗越;;小細(xì)胞肺癌選擇性支氣管動(dòng)脈灌注化療近期療效分析(摘要)[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第六屆全國結(jié)核病學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編[C];2000年

6 萬會(huì)平;;小細(xì)胞肺癌治療進(jìn)展[A];江西省中醫(yī)藥學(xué)會(huì)2011年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2011年

7 丁小青;蔣留留;張志堅(jiān);王梅;許文榮;朱偉;錢暉;;轉(zhuǎn)移性人小細(xì)胞肺癌裸鼠模型的建立[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國中青年檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2012年

8 程穎;柳菁菁;;小細(xì)胞肺癌內(nèi)科治療的探索[A];第13屆全國肺癌學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編[C];2013年

9 張軍;李厚文;;化療、放療,加顱腦預(yù)防性放射,治愈晚期小細(xì)胞肺癌[A];第13屆全國肺癌學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編[C];2013年

10 茍?zhí)m英;安社娟;嚴(yán)紅虹;吳一龍;;基于509例系列患者分析小細(xì)胞肺癌的治療現(xiàn)狀[A];第13屆全國肺癌學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編[C];2013年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 鮑云華;小細(xì)胞肺癌有了新標(biāo)志物[N];健康報(bào);2003年

2 朱立明;“套餐式”療法使小細(xì)胞肺癌患者獲益[N];中國醫(yī)藥報(bào);2007年

3 劉霞;新藥物可抑制小細(xì)胞肺癌細(xì)胞[N];科技日?qǐng)?bào);2009年

4 實(shí)習(xí)生 程鳳;小細(xì)胞肺癌擴(kuò)散與基因缺失相關(guān)[N];科技日?qǐng)?bào);2011年

5 中華胸心血管外科學(xué)會(huì)肺癌學(xué)組組長 支修益;小細(xì)胞肺癌 不容忽視的20%[N];健康報(bào);2013年

6 陳青;敢對(duì)小細(xì)胞肺癌動(dòng)刀[N];文匯報(bào);2003年

7 賀用和 董海濤 林紅生;小細(xì)胞肺癌132例中西醫(yī)結(jié)合治療臨床總結(jié)[N];中國中醫(yī)藥報(bào);2004年

8 中華胸心血管外科學(xué)會(huì)肺癌學(xué)組組長 支修益;ProGRP檢測助力小細(xì)胞肺癌管理[N];中國醫(yī)藥報(bào);2013年

9 常怡勇;吸煙者突然厭煙當(dāng)心肺癌[N];中國中醫(yī)藥報(bào);2006年

10 唐夏;吸煙低齡化導(dǎo)致肺癌低齡化[N];中國消費(fèi)者報(bào);2007年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 姜文華;MiR-22對(duì)小細(xì)胞肺癌放療敏感性的影響及相關(guān)機(jī)制研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2017年

2 王平;小細(xì)胞肺癌個(gè)體化放射治療方案的優(yōu)化[D];天津醫(yī)科大學(xué);2015年

3 姜威;凋亡通路基因的MicroRNA相關(guān)單核苷酸多態(tài)性與局限期小細(xì)胞肺癌預(yù)后的關(guān)聯(lián)研究和調(diào)強(qiáng)放療與三維適形放療技術(shù)對(duì)局部晚期非小細(xì)胞肺癌放射性肺損傷影響的臨床研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2016年

4 王希明;人附睪蛋白4(HE4)作為新型腫瘤標(biāo)志物在小細(xì)胞肺癌應(yīng)用的初步研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2016年

5 吳紅波;沉默SURVIVIN抑制小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和逆轉(zhuǎn)化療耐藥性研究[D];鄭州大學(xué);2016年

6 李玲玉;FLI1環(huán)狀RNA在小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機(jī)理[D];吉林大學(xué);2017年

7 楊翔;miRNA-30a-5p/Beclin-1信號(hào)軸在人小細(xì)胞肺癌化療耐藥表型形成中的作用及分子機(jī)制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2017年

8 焉春華;通過深度測序?qū)π〖?xì)胞肺癌樣本進(jìn)行微小RNA的發(fā)現(xiàn)及表達(dá)分析[D];哈爾濱醫(yī)科大學(xué);2014年

9 陳駿;小細(xì)胞肺癌的預(yù)后因素[D];中國醫(yī)科大學(xué);2009年

10 王淳;胎盤生長因子在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞穿過血腦屏障中的作用[D];中國醫(yī)科大學(xué);2007年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 俞波;小細(xì)胞肺癌伴抗利尿激素分泌不當(dāng)綜合征[D];山東大學(xué);2009年

2 楊光;小細(xì)胞肺癌腫瘤標(biāo)志物檢測的臨床意義[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

3 梁珍;多西紫杉醇靶向納米藥物對(duì)小細(xì)胞肺癌治療作用的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2015年

4 趙傳多;Ⅱ-ⅢA期小細(xì)胞肺癌外科治療臨床研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2015年

5 何花;小細(xì)胞肺癌中毒蕈堿膽堿受體3的表達(dá)及意義[D];寧夏醫(yī)科大學(xué);2015年

6 趙維川;多指標(biāo)聯(lián)合檢測在小細(xì)胞肺癌診斷中的應(yīng)用價(jià)值研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

7 臧婉娜;局限期小細(xì)胞肺癌不同治療模式的對(duì)比研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

8 李治樺;小細(xì)胞肺癌二線化療方案療效分析及診斷和療效預(yù)測相關(guān)多肽的探索性研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2015年

9 孔月;低鈉血癥與小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后關(guān)系的研究[D];蘇州大學(xué);2015年

10 王靜;75例小細(xì)胞肺癌患者血液高凝狀態(tài)的臨床研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2015年

，

本文編號(hào)：2507298