【摘要】：研究背景與目的近年來,以基因分型為基礎(chǔ)的個體化的分子靶向治療已成為非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)里程碑式的治療方案。其中最具代表性的是：針對表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor, EGFR)基因突變開展的分子靶向治療。具有EGFR敏感突變的NSCLC患者接受酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors, TKIs)治療,其有效率高達700%。但是,大部分患者在持續(xù)用藥約1年時會出現(xiàn)"TKIs獲得性耐藥”,最終致使腫瘤復發(fā)或進展,嚴重影響了靶向治療的效果和患者預后。 TKIs獲得性耐藥的分子機制主要為"T790M繼發(fā)性突變”和"MET異常擴增”。研究發(fā)現(xiàn),約50%TKIs獲得性耐藥患者出現(xiàn)T790M突變,約22%發(fā)生MET基因擴增,此兩者可獨立或同時出現(xiàn),約占總獲得性耐藥的60%。此外,腫瘤抑制基因PTEN的表達缺失、腫瘤細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)、Axl激活、小細胞肺癌轉(zhuǎn)化等機制也可導致TKIs獲得性耐藥。如何針對獲得性耐藥機制進行早期分子診斷并有效分子干預是臨床上亟待解決的問題。 miRNAs (microRNAs)是一類長度約為22個核苷酸的小分子非編碼RNA,其可通過與靶基因mRNA3'非編碼區(qū)(Untranslated Regions, UTR)的互補結(jié)合,抑制靶基因mRNA翻譯或促進mRNA降解來下調(diào)靶基因的表達。越來越多的研究發(fā)現(xiàn),miRNAs的表達改變能引起抑癌基因或原癌基因的表達異常,繼而調(diào)節(jié)增殖、凋亡、分化及代謝等腫瘤惡性生物學行為,促使腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移。在miRNAs參與TKIs獲得性耐藥的研究領(lǐng)域中,Garofalo等在《Nature Medicine》雜志中闡述了重要耐藥機制“MET基因擴增”調(diào)節(jié)的miRNAs對獲得性耐藥的調(diào)控作用。此研究提示miRNAs有潛力成為TKIs獲得性耐藥的分子干預靶點。 既然miRNAs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及TKIs耐藥中可起到重要的調(diào)節(jié)作用,同時有鑒于TKIs耐藥機制復雜多樣,那么在其它原因引起的TKIs耐藥中是否與miRNAs的表達異常及調(diào)控有關(guān)?miRNAs調(diào)控TKIs獲得性耐藥的作用機制是什么?這些問題尚未有答案!因此,本探究將通過miRNA芯片篩選PC9(吉非替尼敏感細胞)與PC9GR(吉非替尼獲得性耐藥細胞)之間差異性顯著的miRNAs,研究miRNAs對TKIs耐藥的調(diào)控作用,并探討其在TKIs耐藥中的機制。 實驗方法 1.通過ARMS去檢測PC9GR細胞EGFR基因突變；0μM、0.1μM、2μM、5μM、10μM的吉非替尼(Gefitinib)干預PC9和PC9GR細胞,用CCK8、western blot法檢測細胞對Gefitinib的敏感性及Gefitinib干預后p-EGFR、p-ERK、 p-AKT的蛋白表達變化；microarray篩選PC9和PC9GR之間差異表達miRNAs并經(jīng)qRT-PCR驗證；在PC9和PC9GR細胞中干預miR-181a表達后,通過CCK8法檢測細胞對Gefitinib敏感性的變化,通過Transwell檢測細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的變化,通過western blot檢測p-ERK和p-AKT蛋白表達變化,通過qRT-PCR和western blot檢測侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)分子的表達變化。 2.通過qRT-PCR檢測47例NSCLC癌組織及其對應的正常組織中miR-181a的表達水平,比較癌組織與正常組織之間miR-181a的表達差異,并分析腫瘤組織中miR-181a表達水平與臨床病理特征之間的關(guān)系； 3.通過Targetscan/miRnada生物信息學預測工具,預測miR-181a可能的靶基因;在PC9和PC9GR細胞中干預miR-181a表達后,通過qRT-PCR和western blot法篩選miR-181a可能調(diào)節(jié)的靶基因；熒光素酶報告基因法驗證miR-181a的靶基因；qRT-PCR和western blot檢測miR-181a和GAS7在NSCLC中的表達,并分析兩者之間的相關(guān)性。 4.通過western blot檢測GAS7在PC9和PC9GR中的表達差異、并檢測siRNA-GAS7對PC9及pcDNA3.1-GAS7對PC9GR GAS7蛋白表達的影響；以PC9為研究對象,實驗分為三組,分別為miR control/pcDNA3.1、miR-181a mimics/pcDNA3.1、miR-181a mimics/pcDNA3.1-GAS7,通過BrdU和流式細胞學檢測細胞對Gefitinib敏感性,并利用IHC和western blot檢測共轉(zhuǎn)染后EMT相關(guān)分子和細胞信號通路的變化；以PC9GR為研究對象,實驗分為三組,分別為inhibitor control/si-NC、miR-181a inhibitor/si-NC、miR-181a inhibitor/si-GAS7,通過BrdU和流式細胞學檢測細胞對Gefitinib敏感性,并利用IHC和western blot檢測共轉(zhuǎn)染后EMT相關(guān)分子和細胞信號通路的變化。 5.通過免疫組化法(immunohistochemistry, IHC)檢測59例NSCLC腫瘤組織GAS7蛋白表達,并分析GAS7蛋白表達與NSCLC I臨床病理特征之間的關(guān)系；結(jié)合生存資料通過單因素分析及多因素分析探討GAS7與NSCLC預后之間的關(guān)系；通過Oncomine和GEO生物信息學數(shù)據(jù)庫分析GAS7在NSCLC腫瘤及正常組織中的表達差異,并在GEO數(shù)據(jù)庫中分析GAS7與耐藥相關(guān)基因VEGF、PTEN和MET之間的相關(guān)性。 實驗結(jié)果 1. miR-181a調(diào)節(jié)PC9和PC9GR對Gefitinib的敏感性 通過高敏感性的ARMS法,我們發(fā)現(xiàn)PC9GR只含有19號外顯子E746-A750缺失突變,而無T790M突變。CCK8檢測發(fā)現(xiàn)PC9對Gefitinib高度敏感,隨Gefitinib藥物濃度的增加,細胞生長被明顯抑制,而PC9GR對Gefitinib產(chǎn)生耐藥。Western blot檢測信號通路發(fā)現(xiàn)PC9細胞p-EGFR、 p-ERK和p-AKT的蛋白表達水平隨Gefitinib濃度增加而被明顯抑制；在PC9GR細胞中,p-ERK和p-AKT的蛋白表達未被Gefitinib抑制,而p-EGFR的蛋白表達在Gefitinib濃度增加至5gM/L時被明顯抑制。通過芯片篩選發(fā)現(xiàn),miR-181a表達水平在PC9GR細胞中顯著高于PC9,提示miR-181a表達上調(diào)可能參與調(diào)節(jié)Gefitinib耐藥。CCK8顯示PC9轉(zhuǎn)染miR-181a mimics后對Gefitinib敏感性降低,而PC9GR轉(zhuǎn)染miR-181a inhibitor后對Gefitinib敏感性增高。Transwell檢測發(fā)現(xiàn)PC9細胞轉(zhuǎn)染miR-181a mimics后,侵襲轉(zhuǎn)移能力顯著增加；而PC9GR細胞轉(zhuǎn)染miR-181a inhibitor后,侵襲轉(zhuǎn)移能力下降。Western blot顯示PC9轉(zhuǎn)染miR-181a mimics后,p-ERK和p-AKT蛋白表達增加,而PC9GR轉(zhuǎn)染miR-181a inhibitor后,p-ERK和p-AKT蛋白表達降低。此外,qRT-PCR和western blot顯示PC9轉(zhuǎn)染miR-181a mimics后,促腫瘤轉(zhuǎn)移分子表達增加,而PC9GR轉(zhuǎn)染miR-181a inhibitor后,促腫瘤轉(zhuǎn)移分子表達下降。 2. miR-181a在NSCLC中的表達及意義 通過qRT-PCR檢測47例NSCLC癌組織及對應正常組織中miR-181a的表達發(fā)現(xiàn),36例患者癌組織中miR-181a表達高于對應正常組織(36/47,76.6%),miR-181a在NSCLC癌組織中的表達水平為對應正常組織的2.45倍,顯著高于正常組織(P0.0001)。進一步分析腫瘤組織中miR-181a表達與NSCLC臨床病理特征之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn),miR-181a高表達與吸煙(P=0.0498)、T2-T4分期(P=0.0458)、P53陽性(P=0.0209)及Ki6730%(P=0.0222)顯著相關(guān),而與年齡(P=0.1742)、性別(P=0.0722)、分化程度(P=0.9067)、病理類型(P=0.1029)、N分期(P=0.2540)和TNM分期(P=0.5529)無關(guān)。 3.GAS7是miR-181a的靶基因 通過Targetscan/miRnada生物信息學工具預測miR-181a可能的靶基因,并經(jīng)qRT-PCR和western blot檢測發(fā)現(xiàn),PC9轉(zhuǎn)染miR-181a mimics后GAS7表達顯著降低,而PC9GR轉(zhuǎn)染miR-181a inhibitor后GAS7表達顯著增加。熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示,miR-181a mimics和miR-181a inhibitor顯著影響野生型pMIR-reporter-GAS73'UTR報告基因熒光素酶活性,而對突變型報告基因熒光素酶活性無影響o qRT-PCR和western blot檢測miR-181a和GAS7相關(guān)性發(fā)現(xiàn),miR-181a與GAS7mRNA和GAS7蛋白表達呈負相關(guān)。 4. miR-181a通過GAS7調(diào)節(jié)PC9和PC9GR對Gefitinib敏感性 Western blot顯示GAS7蛋白表達水平在PC9GR中低于PC9。BrdU和流式細胞學檢測顯示,PC9細胞轉(zhuǎn)染miR-181a mimics后對Gefitinib敏感性降低,而在miR-181a mimics轉(zhuǎn)染后過表達GAS7可重新促使PC9對Gefitinib敏感；PC9GR轉(zhuǎn)染miR-181a inhibitor后對Gefitinib敏感性增加,而在miR-181a inhibitor轉(zhuǎn)染后沉默GAS7可再次降低PC9GR對Gefitinib的敏感性。IHC和Western blot顯示,PC9轉(zhuǎn)染miR-181a mimics后過表達GAS7可逆轉(zhuǎn)miR-181a mimics的干預效果；同樣,PC9GR轉(zhuǎn)染miR-181a inhibitor后沉默GAS7可逆轉(zhuǎn)miR-181a inhibitor對PC9GR的干預效果。 5.GAS7在NSCLC中的表達及其意義 59例NSCLC中,腺癌GAS7蛋白高表達比例顯著高于鱗癌(P=0.001)；TNM Ⅰ期中GAS7蛋白高表達比例顯著高于Ⅱ期和Ⅲ期(P=0.033),而GAS7蛋白表達與性別、年齡、分化程度、腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯關(guān)系(P0.05)。Kaplan Meier生存曲線顯示GAS7蛋白高表達患者總體生存時間顯著優(yōu)于GAS7蛋白低表達患者(P=0.0315)。多因素分析顯示TNM分期為NSCLC患者預后的獨立危險因素。分析Oncomine數(shù)據(jù)庫入組的8項研究,有7項研究顯示腫瘤組織中GAS7mRNA表達水平顯著低于正常組織(P0.001)；進一步對GEO數(shù)據(jù)庫中GSE31210分析,GAS7與TKIs耐藥相關(guān)基因MET (rpearson=-0.205,P=0.0020)、PTEN (rpearson=0.431, P0.0001)及VEGF (rpearson=-0.264, P0.0001)呈顯著相關(guān)。 結(jié)論 1.miR-181a在Gefitinib耐藥細胞PC9GR中表達增加,其可通過ERK和AKT信號通路,調(diào)節(jié)細胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移能力,進而影響NSCLC對Gefitinib的敏感性。 2.我們認為miR-181a在NSCLC癌組織中表達增加參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展。 3.GAS7是miR-181a的靶基因,miR-181a通過GAS7調(diào)節(jié)PC9和PC9GR對Gefitinib敏感性； 4.我們認為GAS7在NSCLC中表達降低參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展,其在NSCLC中調(diào)節(jié)TKIs耐藥可能與MET、PTEN及VEGF有關(guān),
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2

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