發(fā)布時間：2019-06-19 21:14

【摘要】：背景:膠質母細胞瘤(Glioblastoma)、也稱多形性膠質母細胞瘤Glioblastoma multiforme,GBM),是一類分子異質性極強、且臨床結局較差的腫瘤性疾病。在所有腫瘤相關的分子調控機制中,DNA甲基化在決定腫瘤生物學特征方面發(fā)揮非常重要的作用,其中包括(但不局限于)調控基因表達水平和維持染色體結構的穩(wěn)定。既往研究表明,GBM通常伴隨著顯著的表觀遺傳學改變,其中以全局性非基因區(qū)域DNA重復序列的低甲基化改變和局部基因區(qū)域鑲嵌有CpG島(Cp G island,CGI)超甲基化改變的低甲基化區(qū)段最具特征性。遺憾的是,目前我們對于GBM相關的DNA低甲基化在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用和意義還了解甚少。研究表明:腫瘤基因組DNA甲基化整體水平的下降主要來自于非基因區(qū)域DNA重復序列的甲基化丟失。另一方面,腫瘤相關的DNA超甲基化改變則主要發(fā)生在基因啟動子相關區(qū)域的CpG島結構內。然而,人類基因組中有將近一半的基因,其轉錄調控區(qū)域并不含有CpG島結構,該區(qū)域內DNA甲基化在腫瘤中的改變模式目前尚未有明確結論。本研究旨在利用高通量DNA甲基化檢測技術從組學的水平上探討GBM轉錄組、特別是非CpG島Open sea區(qū)域DNA甲基化的改變模式和意義。方法:本研究共納入129例新發(fā)GBM成年患者(≥18歲)的腫瘤組織樣本和6例接受手術治療的慢性癲癇患者的非腫瘤腦組織對照樣本。所有組織樣本均來自于法國雷恩第一大學附屬雷恩與安格爾醫(yī)院神經(jīng)外科中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤生物樣本庫,病例收集于2004年1月至2013年12月。所有組織樣本的收集及入庫均符合法國生物樣本收集標準及赫爾辛基宣言要求,并取得相應患者的知情同意書。所有納入的GBM病例均接受替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)標準同步放、化療。組織樣本的全基因組DNA甲基化和基因表達水平的檢測工作分別由美國Illumina公司的Infinium HumanMethylation27k/450k芯片平臺和Agilent公司的Whole Genome 4×44K芯片平臺完成。另外,本研究亦納入來自腫瘤基因組圖譜計劃(The Cancer Genome Atlas,TCGA)和基因表達公共數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus,GEO)等公共數(shù)據(jù)庫中不同病例系列的各級別膠質瘤樣本。Illumina甲基化芯片中所有基因(蛋白編碼或非蛋白編碼)相關的探針納入后續(xù)分析。差異甲基化位點和差異表達基因分別由wilcoxon和標準t檢驗進行計算。我們定義GBM特征性改變的甲基化位點符合腫瘤與非腫瘤組織的中位β差值≥0.2且錯誤發(fā)現(xiàn)率(False Discovery Rate,FDR)≤0.05的標準。Pearson關聯(lián)分析用于評估基因甲基化與表達譜數(shù)據(jù)間的關聯(lián)程度。我們定義甲基化依賴的基因表達關系的標準為Pearson系數(shù)的絕對值≥0.3且P≤0.05。研究采用從訓練到驗證的建模思路,建立風險評分模型。生物信息學分析主要包括基因簇富集分析(Gene Set Enrichment analysis,GSEA)和基因功能注釋聚類分析(DAVID)。主成分分析(Principal components analysis,PCA)用于比較不同病理級別或不同組織類型間膠質瘤樣本的DNA甲基化模式。不同組間頻數(shù)的差異由卡方或Fisher精確檢驗進行比較。Log-rank檢驗用于比較不同組間總體生存期(Overall survival,OS)的差異,Kaplan-Meier法用于計算患者生存率,所有檢驗均采用雙側檢驗,P≤0.05為具有統(tǒng)計學意義。統(tǒng)計分析軟件均采用R軟件。結果:我們一共篩選出801個CpG位點作為GBM特征性甲基化位點的代表,這些位點在納入分析的4組病例組中的至少3組中符合腫瘤特征性甲基化位點的定義。其中399個CpG位點在GBM中發(fā)生超甲基化改變,402個位點發(fā)生低甲基化改變。PCA分析結果支持上述CpG位點的可靠性。通過分析這些CpG位點在GBM中甲基化水平的改變模式與其CpG島距離定位關系之間的分布特征,我們發(fā)現(xiàn),絕大多數(shù)(97%)CpG島內的CpG位點在腫瘤中發(fā)生超甲基化改變,而這一比例隨著位點與相鄰CpG島之間的距離的增加而下降,只有75%的Shore區(qū)域內的CpG位點和37%的Shelf區(qū)域內的CpG位點在腫瘤中發(fā)生超甲基化改變。然而對于距離CpG島最遠的Open Sea區(qū)域內的CpG位點,只有7%發(fā)生超甲基化改變。換句話說,非CpG島Open Sea區(qū)域內的CpG位點絕大多數(shù)(93%)在GBM中發(fā)生低甲基化改變�；虮磉_數(shù)據(jù)關聯(lián)分析表明:非CpG島Open sea區(qū)域相關的基因,相對于那些CpG島及CpG島鄰近區(qū)域相關的基因,其發(fā)生腫瘤相關的差異表達和DNA甲基化依賴的基因表達的概率顯著降低�；颊呖傮w生存期關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn):在所有預后相關的CpG點中,幾乎所有(96-100%)來自CpG島區(qū)域的位點的DNA甲基化均與患者生存數(shù)據(jù)呈負相關關系。相反,幾乎所有(96-100%)來自非CpG島Open Sea區(qū)域的位點的DNA甲基化與患者生存時間呈正相關關系。DAVID數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn):對應于CpG島區(qū)域位點的眾多基因中,主要富集與發(fā)育和轉錄過程相關的基因,而對應于非CpG島Open Sea區(qū)域位點的基因中,主要富集與免疫反應相關的基因。接下來我們建立了一組基于8個免疫基因相關的非CpG島Open Sea區(qū)域CpG位點甲基化狀態(tài)的風險評分方程。具體方程如下:風險分值=(-1.07×cg02833180探針的β值)+(-3.06×cg09238677探針的β值)+(-1.89×cg18343292探針的β值)+(-1.54×cg18854666探針的β值)+(-1.65×cg18881723探針的β值)+(-3.44×cg25511807探針的β值)+(-1.93×cg26066361探針的β值)+(-1.65×cg22502502探針的β值)。我們計算出最佳分組界值為-5.17(約為所有訓練組樣本風險分值的第40%分位數(shù))。生存分析表明,甲基化風險評分方程在不同的病例組中均能夠穩(wěn)定、準確地預測患者的生存期。Cox風險回歸分析表明,甲基化風險評分方程是獨立的預后指示因子。GSEA分析提示:甲基化風險評分方程的分組與不同的表達譜免疫表型密切相關:高風險組樣本富集免疫功能相關的基因簇,說明這些腫瘤具有免疫異常激活的表型。我們還發(fā)現(xiàn):在GBM中發(fā)生特征性改變的甲基化位點在較低級別膠質瘤(Lower grade glioma,LGG)中也同樣發(fā)生改變,只是程度不同。與非腫瘤腦組織相比,各級別膠質瘤中CpG島區(qū)域位點的整體DNA甲基化程度明顯增高,而在不同病理級別的膠質瘤之間,CpG島區(qū)域位點的整體DNA甲基化程度變化趨于平緩;相反,非CpG島Open Sea區(qū)域位點的整體DNA甲基化水平在LGG與非腫瘤腦組織之間的差異程度并不明顯,但隨著病理級別的升高,該區(qū)域內的DNA甲基化程度顯著降低,尤以GBM為甚。最后,甲基化風險評分方程在LGG中也與患者預后和表達譜免疫表型密切相關。結論:本研究從組學水平上探討基因非CpG島Open sea區(qū)域DNA低甲基化在GBM中的臨床和生物學意義。我們發(fā)現(xiàn):與基因CpG島超甲基化相似,非CpG島Open sea區(qū)域DNA低甲基化改變也是GBM中特征性發(fā)生的表觀遺傳學分子改變,提示其在GBM分子診斷中具有潛在價值。與CpG島和CpG島相鄰區(qū)域比較,非CpG島Open sea區(qū)域內的DNA甲基化改變對基因表達水平的影響相對有限。更重要的是,我們發(fā)現(xiàn)了基因非CpG島Open sea區(qū)域DNA甲基化與患者生存期之間廣泛存在的正相關關系,提示其在GBM預后評估中的重要意義。我們所建立的基于8個免疫基因相關的Open sea區(qū)域低甲基化的風險評分方程就是一個具有潛在實用價值的GBM預后評估工具。該甲基化評分方程與免疫表型之間的密切關系提示其在腫瘤表觀遺傳學和免疫治療中可能具有指導價值。不同表觀遺傳學區(qū)域的DNA甲基化在膠質瘤發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮了不同的作用,CpG島的DNA超甲基化改變很可能主要與膠質瘤發(fā)病過程相關,而非CpG島Open sea區(qū)域的DNA低甲基化改變則有可能主要在膠質瘤進展惡化過程中發(fā)揮作用。綜上所述,本研究首次從組學水平上著重強調了基因非CpG島Open sea區(qū)域DNA低甲基化改變在膠質瘤發(fā)生、發(fā)展中的重要作用,未來還需要更多的研究來關注該區(qū)域內DNA甲基化改變在腫瘤生物學中的重要意義。
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【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R739.41
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本文編號：2502652