【摘要】：研究背景:結(jié)直腸腫瘤是一種常見的消化道腫瘤,其中結(jié)直腸癌已成為世界上發(fā)病率排名第三及造成居民死亡排名第四位的惡性腫瘤。在我國(guó)常見的惡性腫瘤死亡病例中,結(jié)直腸癌也占有很高的比例,并且近幾年其發(fā)病率有逐漸增加的趨勢(shì),嚴(yán)重影響了人民的身體健康。結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生發(fā)展與遺傳、生活方式及環(huán)境等多種因素相關(guān),目前有研究表明腸道微生物與結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的聯(lián)系,但關(guān)于腸道微生物與結(jié)直腸腫瘤發(fā)生的確切關(guān)系尚不清楚。有兩種關(guān)于腸道菌群與結(jié)直腸癌關(guān)系的假說(shuō),分別是"Alpha-Bugs"假說(shuō)和"driver-passenger"假說(shuō)。目的和意義:在本文中我們通過(guò)對(duì)來(lái)源于不同患者腸道黏膜的微生物進(jìn)行分析,為了找出結(jié)直腸腫瘤不同階段的腸道黏膜微生物的差異,同時(shí)我們還想尋找與結(jié)直腸腫瘤相關(guān)的黏膜微生物標(biāo)記物。研究方法:本文中所用到的的腸道微生物樣本來(lái)源于2015年10月Nature Communication上發(fā)表的一篇文獻(xiàn),樣本的微生物序列是從NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載得到的,所有的序列信息都是公開的。微生物序列經(jīng)過(guò)去噪處理后,先利用UPARSE軟件將所有的序列在95%相似度下進(jìn)行聚類得到OTU,然后使用利用UCHIME將PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的嵌合體從序列中去除,最后我們篩選出每個(gè)OTU中的代表序列,將每個(gè)代表序列與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),最終得到每個(gè)OTU的注釋信息。并對(duì)最后的OTU注釋結(jié)果進(jìn)行了優(yōu)化,去除了注釋信息為古菌和沒有注釋結(jié)果的OTU。最終得到了每個(gè)樣本的OTU組成信息及微生物在門綱目科屬種6個(gè)分類層面上的注釋及組成信息。我們使用R語(yǔ)言分析樣本的α多樣性指數(shù)(包括chao1指數(shù)、shannon指數(shù)以及simpson指數(shù)),樣本的主坐標(biāo)分析,基于距離矩陣的多元方差分析和樣本間的聚類分析,使用QIIME軟件計(jì)算樣本的 β 多樣性指數(shù)(包括 Bray-Curtis,weighted UniFrac 和 unweighted UniFrac 距離),利用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)和Wilcoxon秩和檢驗(yàn)比較組間α多樣性和微生物各分類層面相對(duì)豐度的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,p值使用Benjamini-Hochberg法進(jìn)行校正,校正后認(rèn)為p值小于0.1具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。最后我們使用LEfSe分析結(jié)直腸腫瘤發(fā)生發(fā)展不同階段可能的微生物標(biāo)志物。研究結(jié)果:總共有160人入選本次實(shí)驗(yàn),包括61位經(jīng)腸鏡檢查確認(rèn)腸道無(wú)腫瘤的患者,47位經(jīng)病理確認(rèn)為腺瘤的患者及52位病理確認(rèn)為進(jìn)展期結(jié)直腸腺癌的患者,并分別定義為正常組、腺瘤組和腺癌組。三組患者除了年齡上存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(60.13±5.99,67.32±8.80,67.85±13.18,p0.001),其他各項(xiàng)指標(biāo),包括活檢的部位,一級(jí)親屬腸道腫瘤病史,吸煙飲酒史等均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。數(shù)據(jù)處理后我們一共得到了 1012335條序列,平均每個(gè)樣本含6327條。其中正常組61個(gè)樣本總計(jì)338391條,平均每個(gè)樣本含5547條,腺瘤組47個(gè)樣本總計(jì)327500條,平均每個(gè)樣本含6968條,腺癌組52個(gè)樣本總計(jì)346444條,平均每個(gè)樣本6662條。我們對(duì)所有的序列在95%相似性下聚類,總共得到了 605個(gè)OTU,平均每個(gè)樣本含OTU63個(gè),其中正常組共有445個(gè)OTU,腺瘤組共有417個(gè)OTU,腺癌組共有482個(gè)OTU。OTU Rank曲線提示大部分樣本的OTU數(shù)目在50-150之間,并且所有樣本OTU的分布都不均勻。我們發(fā)現(xiàn)α多樣性指數(shù)中的chao1指數(shù)在三組間有統(tǒng)計(jì)差異(p=0.0006),而三組樣本的shannon指數(shù)與simpson指數(shù)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(shannon指數(shù):p=0.22,simpson指數(shù):p=0.20)。我們使用PCoA來(lái)展現(xiàn)樣本的p多樣性,PCoA分析顯示可以將腺癌組與正常組及腺瘤組分開,而正常組和腺瘤組的樣本比較接近,很難分開,但三組樣本間都存在不同程度的重疊。PERMANOVA分析則顯示三組樣本的微生物組成存在顯著差異。我們使用數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU進(jìn)行物種注釋,得到了微生物在門綱目科屬種幾個(gè)層面上的組成信息,大部分OTU都可以注釋到屬水平上。在門水平上我們一共得到了 12個(gè)門,其中腺瘤組有9個(gè)門,腺癌組有8個(gè)門,正常組有10個(gè)門,大部分微生物屬于厚壁菌門(Firmicutes),擬桿菌門(Bacteroides),放線菌門(Actinobacteria)和變形菌門(Proteobacteria)四類。在科水平我們一共得到了94個(gè)科,其中平均相對(duì)豐度較高的物種包括腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、擬桿菌科(Bacteroidaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)和梭桿菌科(Fusobacteriaceae),其中正常組共有76個(gè)科,腺瘤組中共有75個(gè)科,腺癌組共有80個(gè)科。在屬水平上我們一共得到了 148個(gè)物種,平均相對(duì)豐度較高的物種包括擬桿菌屬(Bacteroides)、埃希菌屬(Escherichia)、梭桿菌屬(Fusobacterium)和鏈球菌屬(Streptococcus),其中正常組共有117個(gè)屬,腺瘤組共有117個(gè)屬,腺癌組共有125個(gè)屬。我們使用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),無(wú)論是在哪個(gè)物種層面上進(jìn)行比較,正常組和腺瘤組的各個(gè)物種的豐度均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。正常組與腺癌組的物種相對(duì)豐度在各個(gè)層面上均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在門水平上,放線菌門(Actinobacteria,p=0.01)和變形菌門(Proteobacteria,p=0.001)在正常組中升高,厚壁菌門(Firmicutes,p=0.07)和梭桿菌門(Fusobacteria,p=0.008)在腺癌組中升高。在屬水平上共有16個(gè)屬具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,酸單胞菌屬(Acidomonas)、Blautia、埃希菌屬(Escherichia)、Faecalibacterium、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)等在正常組中升高,而彎曲桿菌屬(Campylobacter)、戴阿利斯特桿菌屬(Dialister)、艾肯氏菌屬(Eikenella)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、纖毛菌屬(Leptotrichia)、Mogibacterium、微單胞菌屬(Parvimonas)、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)和普雷沃氏菌屬(Prevotella)在腺癌組中升高。腺瘤組與腺癌組相比共有21個(gè)屬具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,其中酸單胞菌屬(Acidomonas)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、水棲菌屬(Enhydrobacter)、埃希菌屬(Escherichia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)和葡萄球菌屬(Staphylococcus)等物種在腺瘤組中顯著升高,而Bulleidia、彎曲菌屬(Campylobacter)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、戴阿利斯特桿菌屬(Dialister)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、纖毛菌屬(Leptotrichia)、Mogibacterium、Odoribacter、顫螺菌屬(Oscillospira)、微單胞菌屬(Parvimonas)、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)、卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)和密螺旋體屬(Treponema)等物種在腺癌組中顯著升高。我們使用LEfSe分析結(jié)直腸腫瘤發(fā)生發(fā)展不同階段可能的微生物標(biāo)志物,其中正常組的微生物標(biāo)記物包括 Actinobacteria、Actinomycetales、Moraxellaceae和 Sphingomonas 等,Alphaproteobacteria、Bacillales、Escherichia coli、Proteobacteria、Pseudomonas和Staphylococcus等在腺瘤組為優(yōu)勢(shì)菌種,腺癌組的微生物標(biāo)記物主要有 Bacilli、Bacteroides_fragilis、Firmicutes、Fusobacterium、Streptococcaceae、Parvimonas 和 Prevotella 等。最后我們利用p多樣性中的unweightedUniFrac距離對(duì)所有的樣本進(jìn)行聚類分析,聚類方法為UPGMA,發(fā)現(xiàn)并非每個(gè)組的樣本都能聚到一起,這說(shuō)明了樣本的個(gè)體間存在差異。結(jié)論:本文對(duì)腸道黏膜微生物的測(cè)序序列進(jìn)行OTU和物種注釋的分析,表現(xiàn)了結(jié)直腸腫瘤發(fā)生發(fā)展的不同階段的黏膜微生物的變化。腺癌組的黏膜微生物與正常組和腺瘤組相比,差別較大,通過(guò)主坐標(biāo)分析能將腺癌組與另兩組分離開。其中具有直接致癌的物種,如梭桿菌屬和脆弱擬桿菌的豐度升高,具有抑制腫瘤發(fā)生的物種,如Faecalibacteriumprausnitzii和Blautia的豐度則降低。正常組與腺瘤組的黏膜微生物比較接近,用主坐標(biāo)分析很難將兩者分開,并且在各個(gè)分類層面上兩者的物種比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明有其他混雜因素存在,需要進(jìn)一步分析這些因素。本次研究使用了 LEfSe篩選了各個(gè)組的標(biāo)志物,各個(gè)組的標(biāo)志物均有不同,說(shuō)明在結(jié)直腸腫瘤發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中腸道微生物發(fā)生了較大的變化,腸道微生物可能在腫瘤形成過(guò)程中起到了一定的作用。大腸桿菌在腺瘤組中高于腺癌組,表明大腸桿菌在腫瘤發(fā)生的早期發(fā)揮作用,在腫瘤發(fā)展的后期被其他更適宜腫瘤微環(huán)境的微生物所取代,這從一個(gè)方面證明了腫瘤與微生物關(guān)系的“driver-passenger”假說(shuō)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.3
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本文編號(hào)：
2501064
