【摘要】：【目的】結(jié)直腸癌(colorectal cancer)是一種常見的消化道惡性腫瘤,其轉(zhuǎn)移是影響結(jié)腸癌患者生存率的主要因素之一,但其轉(zhuǎn)移機(jī)制尚未闡明。本課題旨在探討microRNA(miRNA)在結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)中的作用與分子機(jī)制:1.比較從同一結(jié)腸癌患者原位癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織分別建立的細(xì)胞系SW480和SW620的生物學(xué)特性(遷移、粘附和失巢凋亡抵抗)的差異及相關(guān)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)標(biāo)志物、粘附和凋亡相關(guān)的蛋白分子的表達(dá)差異,以確定兩種細(xì)胞系可作為結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的研究模型;2.篩選并鑒定兩細(xì)胞中差異表達(dá)明顯的miRNA,分析其在結(jié)腸癌組織樣本中的表達(dá)水平與轉(zhuǎn)移的相關(guān)性;分析該miRNA對(duì)SW480和SW620細(xì)胞增殖、遷移、粘附及失巢凋亡抵抗等轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物學(xué)特性及相關(guān)蛋白分子的影響;在動(dòng)物模型明確該miRNA對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用;3.尋找并鑒定該miRNA與轉(zhuǎn)移功能相關(guān)的靶基因,確定靶基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞遷移、粘附、失巢凋亡抵抗以及相關(guān)蛋白分子的調(diào)控作用,闡明該miRNA通過靶基因調(diào)控結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制�！痉椒ā�1.采用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SW480和SW620細(xì)胞遷移、粘附和失巢凋亡抵抗的生物學(xué)特性,通過Western blot檢測(cè)二者中E-cadherin、vimentin、β-integrin和Bcl-2的蛋白水平。2.選擇本室前期利用miRNA表達(dá)譜芯片篩選二者中差異表達(dá)的miRNA,并通過RT-qPCR驗(yàn)證上述表達(dá)差異;利用RT-qPCR法檢測(cè)結(jié)腸原位癌及相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中差異最明顯的miRNA水平,將其表達(dá)差異與臨床病理資料作統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性分析;采用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移侵襲實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)及Western blot檢測(cè)封閉和過表達(dá)該miRNA對(duì)SW480細(xì)胞遷移、粘附和失巢凋亡抵抗能力及E-cadherin、vimentin、β-integrin和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響。利用裸鼠實(shí)驗(yàn)研究體內(nèi)該miRNA對(duì)SW620細(xì)胞形成轉(zhuǎn)移瘤的影響。3.應(yīng)用生物信息學(xué)結(jié)合雙熒光報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)、RT-qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)篩選并驗(yàn)證該miRNA的靶基因及對(duì)靶基因的調(diào)控作用。此外,RT-q PCR和免疫組織化學(xué)分別檢測(cè)靶基因在結(jié)腸癌組織中的mRNA及蛋白表達(dá),將原位癌與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中的靶基因與鑒定的miRNA表達(dá)差異作統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性分析;利用細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、粘附實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)和Western blot檢測(cè)敲降和過表達(dá)靶基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞遷移、粘附、失巢凋亡抵抗能力及β-integrin、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響�！窘Y(jié)果】1.與SW620細(xì)胞相比,SW480細(xì)胞具有較強(qiáng)的遷移能力、較弱的細(xì)胞粘附和失巢凋亡抵抗能力以及低表達(dá)的E-cadherin、β-integrin和Bcl-2分子。2.miR-10a在結(jié)腸原位癌細(xì)胞(SW480)和組織中的表達(dá)明顯高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞(SW620)和組織(P0.05),其在結(jié)腸原位癌與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織的表達(dá)差異與腫瘤的轉(zhuǎn)移距離和浸潤(rùn)深度呈負(fù)相關(guān)(P0.05);封閉miR-10a抑制結(jié)腸癌細(xì)胞SW480遷移、促進(jìn)粘附和失巢凋亡抵抗。Western blot結(jié)果顯示封閉miR-10a抑制SW480細(xì)胞EMT、促進(jìn)β-integrin和Bcl-2表達(dá),過表達(dá)miR-10a具有相反作用。裸鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,miR-10a抑制SW620細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移瘤形成(P0.05)。3.生物信息學(xué)分析結(jié)合雙熒光報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)、RT-qPCR與Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-10a靶定基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP14)和肌動(dòng)蛋白-γ(ACTG1)的3’UTR并負(fù)向調(diào)控其表達(dá)。RT-qPCR和免疫組織化學(xué)結(jié)果表明MMP14和ACTG1在原位癌與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中mRNA表達(dá)差異分別與miR-10a表達(dá)差異呈負(fù)相關(guān)(P0.05);過表達(dá)MMP14和ACTG1促進(jìn)SW480細(xì)胞遷移和粘附(P0.05);敲降MMP14和ACTG1表達(dá),抑制SW480細(xì)胞粘附(P0.05),與β-integrin蛋白表達(dá)水平降低有關(guān)。敲降MMP14和ACTG1降低SW620細(xì)胞的失巢凋亡抵抗能力(P0.05),過表達(dá)MMP14和ACTG1增強(qiáng)SW620細(xì)胞抵抗失巢凋亡的能力(P0.05),分別與β-integrin和Bcl-2蛋白表達(dá)升高和降低有關(guān)(P0.05)�！窘Y(jié)論】1.SW480與SW620細(xì)胞代表結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移發(fā)展進(jìn)程的不同階段,存在轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物學(xué)特性差異。2.miR-10a通過促進(jìn)EMT和失巢凋亡促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移和侵襲、抑制粘附和抗失巢凋亡,最終抑制結(jié)腸癌細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移。3.MMP14和ACTG1為miR-10a負(fù)向調(diào)控的直接靶基因,二者通過正向調(diào)控β-integrin和Bcl-2表達(dá)發(fā)揮促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移、粘附和失巢凋亡抵抗的作用。本研究為闡明結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)及分子途經(jīng),為結(jié)腸癌的治療提供了可能的新靶點(diǎn)。
[Abstract]:[Objective] To study the role and molecular mechanism of microRNA (miRNA) in the invasion and metastasis of colon cancer. [Methods] 1. The protein levels of E-cadherin, vimentin, HCO3-integrin and Bcl-2 in SW480 and SW620 cells were detected by transwell migration experiment, cell adhesion test and flow cytometry. [Results] 1. The expression of SW480 cells in colorectal cancer cells (SW480) and tissue was significantly higher than that of SW620 cells (P0.05). [Conclusion] 1.SW480 and SW620 cells represent different stages of the progression of colon cancer metastasis, and there are different biological characteristics of metastasis.2. miR-10a promotes the migration and invasion of colon cancer cells by promoting EMT and the apoptosis, and finally inhibits the in vivo transfer of colon cancer cells.3. MMP14 and ACTG1 are the direct target genes for the negative regulation of miR-10a. Both of them play a role in promoting the migration, adhesion and apoptosis resistance of colon cancer cells by forward and control of the mechanisms of human colon cancer metastasis. The study provides a new experimental basis and molecular route for elucidating the mechanism of colon cancer metastasis, and provides a possible new target for the treatment of colon cancer.
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.3

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8 王國(guó)強(qiáng);方m錁，

本文編號(hào)：2495652