發(fā)布時間：2019-06-09 15:20

【摘要】：【目的】結直腸癌(colorectal cancer)是一種常見的消化道惡性腫瘤,其轉(zhuǎn)移是影響結腸癌患者生存率的主要因素之一,但其轉(zhuǎn)移機制尚未闡明。本課題旨在探討microRNA(miRNA)在結腸癌侵襲轉(zhuǎn)中的作用與分子機制:1.比較從同一結腸癌患者原位癌和淋巴結轉(zhuǎn)移癌組織分別建立的細胞系SW480和SW620的生物學特性(遷移、粘附和失巢凋亡抵抗)的差異及相關的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)標志物、粘附和凋亡相關的蛋白分子的表達差異,以確定兩種細胞系可作為結腸癌轉(zhuǎn)移的研究模型;2.篩選并鑒定兩細胞中差異表達明顯的miRNA,分析其在結腸癌組織樣本中的表達水平與轉(zhuǎn)移的相關性;分析該miRNA對SW480和SW620細胞增殖、遷移、粘附及失巢凋亡抵抗等轉(zhuǎn)移相關的生物學特性及相關蛋白分子的影響;在動物模型明確該miRNA對結腸癌細胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用;3.尋找并鑒定該miRNA與轉(zhuǎn)移功能相關的靶基因,確定靶基因?qū)Y腸癌細胞遷移、粘附、失巢凋亡抵抗以及相關蛋白分子的調(diào)控作用,闡明該miRNA通過靶基因調(diào)控結腸癌轉(zhuǎn)移的分子機制。【方法】1.采用Transwell遷移實驗、細胞粘附實驗及流式細胞術檢測SW480和SW620細胞遷移、粘附和失巢凋亡抵抗的生物學特性,通過Western blot檢測二者中E-cadherin、vimentin、β-integrin和Bcl-2的蛋白水平。2.選擇本室前期利用miRNA表達譜芯片篩選二者中差異表達的miRNA,并通過RT-qPCR驗證上述表達差異;利用RT-qPCR法檢測結腸原位癌及相應淋巴結轉(zhuǎn)移癌組織中差異最明顯的miRNA水平,將其表達差異與臨床病理資料作統(tǒng)計學相關性分析;采用細胞增殖實驗、Transwell遷移侵襲實驗、細胞粘附實驗、流式細胞術及Western blot檢測封閉和過表達該miRNA對SW480細胞遷移、粘附和失巢凋亡抵抗能力及E-cadherin、vimentin、β-integrin和Bcl-2蛋白表達的影響。利用裸鼠實驗研究體內(nèi)該miRNA對SW620細胞形成轉(zhuǎn)移瘤的影響。3.應用生物信息學結合雙熒光報告載體實驗、RT-qPCR和Western blot實驗篩選并驗證該miRNA的靶基因及對靶基因的調(diào)控作用。此外,RT-q PCR和免疫組織化學分別檢測靶基因在結腸癌組織中的mRNA及蛋白表達,將原位癌與淋巴結轉(zhuǎn)移癌組織中的靶基因與鑒定的miRNA表達差異作統(tǒng)計學相關性分析;利用細胞遷移實驗、粘附實驗、流式細胞術和Western blot檢測敲降和過表達靶基因?qū)Y腸癌細胞遷移、粘附、失巢凋亡抵抗能力及β-integrin、Bcl-2蛋白表達的影響�！窘Y果】1.與SW620細胞相比,SW480細胞具有較強的遷移能力、較弱的細胞粘附和失巢凋亡抵抗能力以及低表達的E-cadherin、β-integrin和Bcl-2分子。2.miR-10a在結腸原位癌細胞(SW480)和組織中的表達明顯高于淋巴結轉(zhuǎn)移癌細胞(SW620)和組織(P0.05),其在結腸原位癌與淋巴結轉(zhuǎn)移癌組織的表達差異與腫瘤的轉(zhuǎn)移距離和浸潤深度呈負相關(P0.05);封閉miR-10a抑制結腸癌細胞SW480遷移、促進粘附和失巢凋亡抵抗。Western blot結果顯示封閉miR-10a抑制SW480細胞EMT、促進β-integrin和Bcl-2表達,過表達miR-10a具有相反作用。裸鼠實驗結果顯示,miR-10a抑制SW620細胞肝轉(zhuǎn)移瘤形成(P0.05)。3.生物信息學分析結合雙熒光報告載體實驗、RT-qPCR與Western blot實驗證實miR-10a靶定基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP14)和肌動蛋白-γ(ACTG1)的3’UTR并負向調(diào)控其表達。RT-qPCR和免疫組織化學結果表明MMP14和ACTG1在原位癌與淋巴結轉(zhuǎn)移癌組織中mRNA表達差異分別與miR-10a表達差異呈負相關(P0.05);過表達MMP14和ACTG1促進SW480細胞遷移和粘附(P0.05);敲降MMP14和ACTG1表達,抑制SW480細胞粘附(P0.05),與β-integrin蛋白表達水平降低有關。敲降MMP14和ACTG1降低SW620細胞的失巢凋亡抵抗能力(P0.05),過表達MMP14和ACTG1增強SW620細胞抵抗失巢凋亡的能力(P0.05),分別與β-integrin和Bcl-2蛋白表達升高和降低有關(P0.05)�！窘Y論】1.SW480與SW620細胞代表結腸癌轉(zhuǎn)移發(fā)展進程的不同階段,存在轉(zhuǎn)移相關的生物學特性差異。2.miR-10a通過促進EMT和失巢凋亡促進結腸癌細胞遷移和侵襲、抑制粘附和抗失巢凋亡,最終抑制結腸癌細胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移。3.MMP14和ACTG1為miR-10a負向調(diào)控的直接靶基因,二者通過正向調(diào)控β-integrin和Bcl-2表達發(fā)揮促進結腸癌細胞遷移、粘附和失巢凋亡抵抗的作用。本研究為闡明結腸癌轉(zhuǎn)移的機制提供了新的實驗依據(jù)及分子途經(jīng),為結腸癌的治療提供了可能的新靶點。
[Abstract]:[Objective] To study the role and molecular mechanism of microRNA (miRNA) in the invasion and metastasis of colon cancer. [Methods] 1. The protein levels of E-cadherin, vimentin, HCO3-integrin and Bcl-2 in SW480 and SW620 cells were detected by transwell migration experiment, cell adhesion test and flow cytometry. [Results] 1. The expression of SW480 cells in colorectal cancer cells (SW480) and tissue was significantly higher than that of SW620 cells (P0.05). [Conclusion] 1.SW480 and SW620 cells represent different stages of the progression of colon cancer metastasis, and there are different biological characteristics of metastasis.2. miR-10a promotes the migration and invasion of colon cancer cells by promoting EMT and the apoptosis, and finally inhibits the in vivo transfer of colon cancer cells.3. MMP14 and ACTG1 are the direct target genes for the negative regulation of miR-10a. Both of them play a role in promoting the migration, adhesion and apoptosis resistance of colon cancer cells by forward and control of the mechanisms of human colon cancer metastasis. The study provides a new experimental basis and molecular route for elucidating the mechanism of colon cancer metastasis, and provides a possible new target for the treatment of colon cancer.
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.3

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本文編號：2495652