發(fā)布時(shí)間：2019-06-06 00:23

【摘要】：研究背景Trastuzumab等HER2靶向藥物耐藥是HER2陽性乳腺癌治療研究中的熱點(diǎn)問題之一。有研究表明,PI3K-AKT信號(hào)通路異常激活是HER2靶向藥物耐藥的關(guān)鍵分子基礎(chǔ),但其機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。PRAS40的Thr246位點(diǎn)磷酸化(p-PRAS40-Thr246)是最近發(fā)現(xiàn)的能代表PI3K-AKT信號(hào)通路激活狀態(tài)的分子標(biāo)記,p-PRAS40-Thr246是PI3K-AKT通路激活重要的下游因子,并與脂類代謝異常相關(guān)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)p-PRAS40-Thr246在乳腺癌標(biāo)本中表達(dá)升高,并是乳腺癌預(yù)后的獨(dú)立影響因子。據(jù)此,我們提出"PRAS40-Thr246磷酸化可能是HER2陽性乳腺癌細(xì)胞trastuzumab耐藥的關(guān)鍵調(diào)控因子和耐藥逆轉(zhuǎn)靶點(diǎn)”的假說,并擬針對(duì)以下科學(xué)問題進(jìn)行深入研究：1.從臨床水平開展更大樣本量的驗(yàn)證,以明確p-PRAS40-Thr246與HER2陽性乳腺癌trastuzumab耐藥的相關(guān)性,探討其與乳腺癌各臨床病理參數(shù)及其乳腺癌患者預(yù)后之間的關(guān)系；2.從細(xì)胞水平驗(yàn)證p-PRAS40-Thr246是否是PI3K-AKT通路導(dǎo)致trastuzumab耐藥的關(guān)鍵因子；3.通過建立乳腺癌trastuzumab耐藥的裸鼠動(dòng)物模型,驗(yàn)證拮抗p-PRAS40-Thr246能否逆轉(zhuǎn)乳腺癌的trastuzumab耐藥。期望通過以上研究進(jìn)一步闡明HER2陽性乳腺癌trastuzumab耐藥的新機(jī)制,為trastuzumab和MK-2206聯(lián)合治療HER-2陽性乳腺癌方案的臨床應(yīng)用提供研究依據(jù)。第一部分PRAS40-Thr246磷酸化與HER2陽性乳腺癌組織trastuzumab耐藥的相關(guān)性的臨床研究目的通過對(duì)臨床乳腺癌組織標(biāo)本的檢測(cè)及病例資料的分析,探討乳腺癌組織p-PRAS40-Thr246的表達(dá)水平與其臨床病理資料、PI3K-AKT信號(hào)通路激活狀態(tài)之間的相關(guān)性。并分析P-PRAS40-THR24是否能成為預(yù)測(cè)乳腺癌trastuzumab治療效果的分子標(biāo)記物。材料和方法：收集了55例HER2陽性的原發(fā)性乳腺癌的癌組織標(biāo)本,這些患者術(shù)后均應(yīng)用trastuzumab治療。所有標(biāo)本都是術(shù)中取材,并且通過福爾馬林固定、石蠟包埋的保存。所有的腫瘤臨床病理資料、治療情況和后續(xù)的疾病進(jìn)展情況都是從患者的病歷及隨訪資料中獲得的。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)。p-PRAS40-Thr246和PTEN在乳腺癌組織中的表達(dá)情況；應(yīng)用等位基因特異PCR檢測(cè)PIK3CA基因的突變情況。P-PRAS40-Thr246表達(dá)與其他臨床病理資料的相關(guān)性分析是用卡方檢驗(yàn)來分析,用Kaplan-Meier方法分析TTP數(shù)據(jù),實(shí)驗(yàn)組之間的差異是用log-rank檢驗(yàn)來分析,p-PRAS40-Thr246的表達(dá)對(duì)乳腺癌trastuzumab治療效果的影響用COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型來分析。結(jié)果1.乳腺癌組織p-PRAS40-Thr246的表達(dá)水平與其臨床病理資料之間沒有顯著相關(guān)性。在本研究中,IHC被用于檢測(cè)p-PRAS40-Thr246在HER2陽性乳腺癌組織中的表達(dá),用于IHC的p-PRAS40-Thr246抗體的特異性及適用性已經(jīng)被以往的研究所證實(shí)。結(jié)果如圖1所示,p-PRAS40-Thr246在乳腺癌細(xì)胞的胞漿中不同強(qiáng)度地廣泛表達(dá),并且偶爾在核內(nèi)表達(dá)。根據(jù)以往的研究,p-PRAS40-Thr246陽性表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)是H評(píng)分≥100。運(yùn)用此標(biāo)準(zhǔn),共有22例(40%)HER2陽性的乳腺癌被定義為p-PRAS40-Thr246陽性。這些患者p-PRAS40-Thr246的表達(dá)水平與其年齡、組織學(xué)分級(jí)、雌孕激素受體情況等臨床病理資料之間沒有顯著相關(guān)性(見表1)。2.乳腺癌組織p-PRAS40-Thr246的表達(dá)水平與PI3K-AKT信號(hào)通路激活狀態(tài)之間有顯著相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)對(duì)入組的HER2陽性乳腺癌的PI3K-AKT通路的激活狀態(tài)進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示,PTEN的缺失在HER2陽性乳腺癌組織中占34.5%(19/55),PIK3CA基因的突變占18.2%(10/55)。另外,在本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的PIK3CA基因突變中,包括7例外顯子20的突變(H1047R)及3例外顯子9的突變(E542K and E545K),這些都與文獻(xiàn)記載的突變情況相一致。根據(jù)文獻(xiàn)建立的標(biāo)準(zhǔn),患者被分為P13K-AKT激活狀態(tài)(PIK3CA突變或PTEN低表達(dá)；n=27)和P13K-AKT未激活狀態(tài)(PIK3CA基因突變類型和PTEN高表達(dá)；n=28)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,p-PRAS40-Thr246的表達(dá)與PI3K-AKT信號(hào)通路激活狀態(tài)、單獨(dú)的PTEN缺失之間有顯著相關(guān)性,但與單獨(dú)的PIK3CA突變之間無顯著相關(guān)性。這些提示了p-PRAS40-Thr246的表達(dá)與PI3K-AKT信號(hào)通路激活狀態(tài)之間,有顯著的相關(guān)性(見表2)。3. P-PRAS40-Thr246可能是一種新型的預(yù)測(cè)乳腺癌trastuzumab治療效果的分子標(biāo)記物。應(yīng)用Kaplan-Meier方法繪制HER2陽性乳腺癌患者的生存曲線(見圖2),在經(jīng)過trastuzumab治療后,p-PRAS40-Thr246陽性的患者比那些p-PRAS40-Thr246陰性的患者有著更短的TTP。單變量回歸分析被用于確定疾病進(jìn)展與HER2陽性乳腺癌trastuzumab治療前PI3K-AKT通路激活狀態(tài)的關(guān)系,PIK3CA基因突變和／或PTEN缺失的患者與其他患者相比,在疾病進(jìn)展方面有更高的風(fēng)險(xiǎn)。單變量回歸分析還顯示,患者組織學(xué)分級(jí)情況也對(duì)患者的總體生存時(shí)間有影響。以上各影響因素均同時(shí)進(jìn)入多因素回歸分析,結(jié)果顯示,p-PRAS40-Thr246陽性是HER2陽性乳腺癌疾病進(jìn)展的一個(gè)有意義的獨(dú)立預(yù)后因子(表2,HR 2.081；95%的可信區(qū)間,1.113-3.890；P=0.022),它能夠預(yù)測(cè)乳腺癌trastuzumab治療的效果。結(jié)論通過臨床標(biāo)本檢測(cè)及相關(guān)病理臨床數(shù)據(jù)的分析,提示P-PRAS40-Thr246在乳腺癌組織中表達(dá),其表達(dá)水平與PI3K-AKT信號(hào)通路激活狀態(tài)之間有顯著相關(guān)性。乳腺癌trastuzumab耐藥的發(fā)生與p-PRAS40-Thr246有關(guān),P-PRAS40-Thr246是PI3K-AKT通路中導(dǎo)致trastuzumab耐藥的關(guān)鍵因子。臨床檢測(cè)p-PRAS40-Thr246可以預(yù)測(cè)乳腺癌trastuzumab治療的效果。第二部分PRAS40-Thr246磷酸化在HER2陽性乳腺癌細(xì)胞trastuzumab耐藥中的作用機(jī)制的細(xì)胞學(xué)研究目的本實(shí)驗(yàn)以乳腺癌SKBR3和SKBR3/TDR細(xì)胞為研究對(duì)象,在細(xì)胞水平探討MK-2206對(duì)其殺傷及逆轉(zhuǎn)trastuzumab耐藥的作用,驗(yàn)證拮抗p-PRAS40-Thr246的表達(dá)能否部分逆轉(zhuǎn)HER2陽性乳腺癌細(xì)胞的trastuzumab耐藥,為乳腺癌的臨床用藥提供依據(jù)。材料和方法通過誘導(dǎo)的方法建立對(duì)trastuzumab耐藥的HER2陽性乳腺癌細(xì)胞株SKBR3/TDR,以不同濃度的MK-2206處理人乳腺癌SKBR3細(xì)胞和SKBR3/TDR細(xì)胞,觀察MK-2206對(duì)SKBR3和SKBR3/TDR細(xì)胞的抑制增殖作用。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的耐藥倍數(shù)和耐藥逆轉(zhuǎn)率,觀察MK-2206與trastuzumab合用對(duì)于SKBR3/TDR細(xì)胞的耐藥逆轉(zhuǎn)情況,采用FCM法檢測(cè)細(xì)胞凋亡以及trastuzumab的蓄積情況。采用Western blot法檢測(cè)]p-PRAS40-Thr246和p-AKT-Thr308蛋白的表達(dá)。觀察MK-2206處理SKBR3和SKBR3/TDR細(xì)胞后,對(duì)p-PRAS40-Thr246和p-AKT-Thr308蛋白的表達(dá)的影響。結(jié)果1.CCK-8檢測(cè)結(jié)果提示,不同濃度的trastuzumab和MK-2206均對(duì)SKBR3和SKBR3/TDR細(xì)胞有抑制增殖的作用,且呈劑量依賴性(圖4、圖5)。其中trastuzumab對(duì)SKBR3和SKBR3/TDR的IC5o分別為(57.32±1.64) ug/ml及(248.24±1.92) ug/ml,耐藥倍數(shù)為4.33倍。MK-2206對(duì)SKBR3和SKBR3/TDR的IC50分別為(40.74±1.66) nmol/L及(43.66±1.43) nmol/L,耐藥倍數(shù)為1.07倍,提示SKBR3/TDR對(duì)MK-2206無耐藥性。不同濃度的MK-2206與trastuzumab合用后,SKBR3和SKBR3/TDR的IC50均有不同程度的下降,但以SKBR3/TDR的下降更明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)(結(jié)果見表3)。2.FCM檢測(cè)結(jié)果顯示,MK-2206可以提高乳腺癌細(xì)胞的凋亡率,但不增加trastuzumab的蓄積.Annexin V-FITC雙染法結(jié)果顯示0、2、4、8nmol/L的MK-2206作用于SKBR3和SKBR3/TDR細(xì)胞24小時(shí)后,均可不同程度提高細(xì)胞凋亡率,以SKBR3/TDR提高更明顯。實(shí)驗(yàn)組凋亡率與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)(結(jié)果見表4、圖6)。FCM法檢測(cè)SKBR3/TDR細(xì)胞內(nèi)trastuzumab含量結(jié)果顯示,加入濃度為0、2、4、8、16nmol/L的MK-2206后,細(xì)胞的熒光強(qiáng)度分別為(2980±14.57)、(3400±16.78)、(3000±12.49)、(2800±10.74)、(3800±18.40)。各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)(圖7)。提示MK-2206不增加trastuzumab在SKBR3/TDR細(xì)胞內(nèi)的蓄積。3. Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示MK-2206可以下調(diào)p-PRAS40-Thr246和p-AKT-Thr308蛋白的表達(dá)。與對(duì)照組相比,不同濃度的MK-2206處理SKBR3/TDR和SKBR3細(xì)胞后,均可以下調(diào)p-PRAS40-Thr246和p-AKT-Thr308蛋白的表達(dá),且呈劑量依賴性(圖8、圖9),實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。結(jié)論通過細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,MK-2206可以下調(diào)p-PRAS40-Thr246的表達(dá),抑制p-PRAS40-Thr246可以逆轉(zhuǎn)乳腺癌對(duì)trastuzumab治療的耐藥,提高其對(duì)trastuzumab的敏感性,可以作為對(duì)SKBR3/TDR細(xì)胞的一種逆轉(zhuǎn)方案。第三部分乳腺癌trastuzumab耐藥裸鼠模型的建立及通過拮抗PRAS40-Thr246磷酸化逆轉(zhuǎn)trastuzumab耐藥的體內(nèi)研究目的體外研究表明,SKBR3/TDR的耐藥與PI3K-AKT通路的激活有關(guān),AKT特異性抑制劑MK2206與trastuzumab的聯(lián)合應(yīng)用能有效逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥并增強(qiáng)細(xì)胞凋亡。是一種潛在的治療方案。為了進(jìn)一步驗(yàn)證其有效性及安全性,我們?cè)诼闶竽Ｐ蜕献隽讼嗨频捏w內(nèi)研究。本部分實(shí)驗(yàn)旨在研究,通過拮抗PRAS40-Thr246磷酸化,逆轉(zhuǎn)治療裸鼠皮下種植性trastuzumab耐藥乳腺癌的療效,為trastuzumab耐藥乳腺癌的治療提供新的思路。材料和方法雌性裸鼠60只,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。于裸鼠腋窩皮下注射SKBR3/TDR細(xì)胞懸液。成瘤后(150mmm3左右)隨機(jī)分4組(n=4)即SKBR3/TDR空白對(duì)照組、SKBR3/TDR應(yīng)用trastuzumab治療組、SKBR3/TDR應(yīng)用MK-2206治療組、SKBR3/TDR應(yīng)用trastuzumab及MK-2206聯(lián)合治療組。trastuzumab溶于生理鹽水中,按4mg/kg腹腔注射,5次/周；MK-2206溶于30%環(huán)糊精中,按120 mg/kg灌胃口服給藥,3次/周；對(duì)照組給予同體積的生理鹽水腹腔注射及灌胃口服30%環(huán)糊精溶液。腫瘤大小用卡尺測(cè)量,計(jì)算公式為V(mm3)=π/6 x長徑x(短徑)2。連續(xù)觀測(cè)20天,20天后切下腫瘤稱重,組織用-80℃保存,western-blot檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。結(jié)果1.生長狀況：向裸鼠腋窩皮下注射5×106 SKBR3/TDR細(xì)胞懸液,3周后裸鼠成瘤(如圖10、圖11、圖12、圖13、圖14所示),經(jīng)過潛伏期后,裸鼠腋窩皮下接種部位可見灰白色結(jié)節(jié),腫瘤呈圓形或橢圓形生長,每5天測(cè)量1次腫瘤體積大小。2拮抗PRAS40-Thr246磷酸化能夠減緩裸鼠乳腺腫瘤的生長,對(duì)腫瘤生長有明顯抑制作用。PRAS40-Thr246磷酸化抑制劑與trastuzumab聯(lián)合應(yīng)用,可有效逆轉(zhuǎn)裸鼠乳腺癌的trastuzumab耐藥,是一種潛在的有效安全的乳腺癌治療方案。Trastuzumab減緩腫瘤生長不明顯,與對(duì)照組相比差異不明顯。MK-2206單獨(dú)治療組可減緩腫瘤生長,但腫瘤仍然增長明顯。相反,trastuzumab與MK-2206聯(lián)合治療組可明顯抑制腫瘤生長,并可相對(duì)減小腫瘤體積(如圖15、表5所示),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。除此之外,裸鼠能耐受藥物治療,治療期間并未出現(xiàn)裸鼠死亡或體重明顯下降等情況,而只是出現(xiàn)瘤體體積的變化。20天后處死裸鼠取瘤,稱瘤體后發(fā)現(xiàn)：聯(lián)合治療組與對(duì)照組相比瘤重明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而單獨(dú)用藥組與對(duì)照組相比有一定程度瘤重減輕,但減少不明顯(如圖16、表6所示)。3. Western-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,MK-2206及Trastuzumab聯(lián)合治療可以下調(diào)裸鼠乳腺癌組織中p-PRAS40-Thr246和p-AKT-Thr308蛋白的表達(dá)(如圖17所示)。此外,與對(duì)照組相比,單獨(dú)應(yīng)用MK-2206能夠降低p-AKT-Thr308蛋白和p-PRAS40-Thr246的表達(dá)量,但單獨(dú)應(yīng)用trastuzumab并未下調(diào)PRAS40的磷酸化。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。這些結(jié)果表明了聯(lián)合應(yīng)用trastuzumab和MK-2206的有效性。結(jié)論通過建立裸鼠HER2陽性乳腺癌模型及相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn),結(jié)果提示：拮抗p-PRAS40-Thr246能夠減緩裸鼠乳腺腫瘤的生長,對(duì)腫瘤生長有明顯抑制作用。MK-2206與trastuzumab聯(lián)合應(yīng)用可以下調(diào)p-PRAS40-Thr246。P-PRAS40-Thr246抑制劑與trastuzumab聯(lián)合應(yīng)用,可有效逆轉(zhuǎn)裸鼠乳腺癌trastuzumab耐藥。P-PRAS40-Thr246是一個(gè)新型的乳腺癌治療靶點(diǎn),為逆轉(zhuǎn)trastuzumab耐藥的研究提供幫助。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.9

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2493929