【摘要】：原發(fā)性肝癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,是全球癌癥死亡病因第二位,嚴(yán)重危害人們的健康。其惡性程度高,治療效果差,病死率較高。肝癌患者5年預(yù)后生存率小于15%,缺乏有效的治療藥物,因此,探索其發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的特異性機(jī)制,有針對(duì)性的預(yù)防和診斷治療,對(duì)肝癌防治有著重要的意義。腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展過(guò)程中需要大量葡萄糖,即使在無(wú)氧條件下,惡性腫瘤細(xì)胞更傾向于無(wú)氧糖酵解的途徑來(lái)獲取能量,這便是著名的瓦博格效應(yīng)。因此,葡萄糖是大多數(shù)惡性腫瘤的能量來(lái)源。目前低糖治療已經(jīng)作為一種新的腫瘤治療方式被運(yùn)用到臨床。靶向能量代謝是抗癌治療的一個(gè)新的方向。二甲雙胍是常用的一種降糖藥。近年研究發(fā)現(xiàn),二甲雙胍具有一定的抗腫瘤作用,減少糖尿病患者罹患惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn),增強(qiáng)藥物的療效。有研究報(bào)道,二甲雙胍一方面能夠減少肝臟糖異生和血液中葡萄糖的釋放,限制了肝臟的緩沖功能,并在營(yíng)養(yǎng)素?cái)z入減少期間加大了血清葡萄糖的降低水平;另一方面,二甲雙胍已被證明是通過(guò)直接抑制可能由短期葡萄糖缺乏引起的能量補(bǔ)充消耗的線粒體呼吸復(fù)合物Ⅰ,阻礙癌癥細(xì)胞的生長(zhǎng)。2-脫氧-D-葡萄糖,是一種葡萄糖類似物,能夠阻斷葡萄糖代謝,損耗腫瘤細(xì)胞的能力供給。有研究報(bào)道,2-脫氧-D-葡萄糖能增加氧化應(yīng)激,抑制糖基化,并誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。也可以有效地延緩細(xì)胞生長(zhǎng),有效促進(jìn)特定的腫瘤細(xì)胞的凋亡。雖然2-脫氧-D-葡萄糖本身在許多類型的癌癥的治療作用有限,它可以結(jié)合其他治療藥物或放射治療具有協(xié)同抗腫瘤作用。細(xì)胞自噬是依賴溶酶體途徑對(duì)胞質(zhì)和細(xì)胞器進(jìn)行降解的一種過(guò)程,在進(jìn)化上具有高度保守性,其在細(xì)胞死亡,細(xì)胞存活,衰老和代謝的生理和病理過(guò)程起著重要的作用。更重要的是,自噬是一個(gè)關(guān)鍵的促進(jìn)細(xì)胞存活的應(yīng)激機(jī)制。PI3K/AKT/m TOR信號(hào)通路具有調(diào)節(jié)自噬的作用。AKT磷酸化是該通路上的一個(gè)的重要環(huán)節(jié),對(duì)腫瘤細(xì)胞存活和凋亡有著重要的作用。本論文通過(guò)研究二甲雙胍聯(lián)合葡萄糖缺乏對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖情況,繼而用2-脫氧-D-葡萄糖代替葡萄糖缺乏,聯(lián)合二甲雙胍對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的作用,并進(jìn)一步探討促凋亡的機(jī)制,以期為預(yù)防和治療肝癌患者提供新的靶點(diǎn)方向。第一章二甲雙胍聯(lián)合葡萄糖缺乏對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響目的:探索二甲雙胍聯(lián)合葡萄糖缺乏對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響方法:1.用全培養(yǎng)液、無(wú)血清培養(yǎng)液以及無(wú)葡萄糖培養(yǎng)液培養(yǎng)肝癌Hep G2、Hep3B、HCCM、Huh7和PLC/5細(xì)胞,利用Wst-1試劑觀察肝癌細(xì)胞不同時(shí)間段的增殖情況。2.利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)全培養(yǎng)液、谷氨酰胺和葡萄糖雙缺乏培養(yǎng)液、葡萄糖補(bǔ)充培養(yǎng)液、谷氨酰胺補(bǔ)充培養(yǎng)液以及兩者均補(bǔ)充培養(yǎng)液培養(yǎng)肝癌細(xì)胞48h后的sub G1凋亡率。3.把二甲雙胍加入到培養(yǎng)液中。實(shí)驗(yàn)分成四組,全培養(yǎng)液組,二甲雙胍全培養(yǎng)液組、無(wú)葡萄糖培養(yǎng)液組和二甲雙胍無(wú)葡萄糖培養(yǎng)液組,培養(yǎng)肝癌Huh7和Hep G2細(xì)胞,分別在24h和48h后觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變,然后利用流式細(xì)胞術(shù)的方法,檢測(cè)肝癌細(xì)胞的存活情況。4.運(yùn)用蛋白免疫印跡技術(shù)分析全培養(yǎng)液組、二甲雙胍全培養(yǎng)液組、無(wú)葡萄糖培養(yǎng)液組和二甲雙胍無(wú)葡萄糖培養(yǎng)液組培養(yǎng)的肝癌Huh7細(xì)胞的PARP、Caspase-3、Mcl-1、LC3及p-AKT等相關(guān)蛋白的變化。結(jié)果:1.無(wú)葡萄糖培養(yǎng)液培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞相比較全培養(yǎng)液和無(wú)血清培養(yǎng)液的培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞,增殖率隨著時(shí)間逐漸下降,其中肝癌Hep G2、HCCM細(xì)胞變化最明顯。2.葡萄糖和谷氨酰胺雙缺乏培養(yǎng)液和谷氨酰胺補(bǔ)充培養(yǎng)液培養(yǎng)的肝癌Hep G2細(xì)胞sub G1凋亡率分別為(94.00±0.50)%和(74.80±1.92)%,與全培養(yǎng)液培養(yǎng)的肝癌Hep G2細(xì)胞sub G1凋亡率(4.40±0.21)%、葡萄糖補(bǔ)充培養(yǎng)液(11.00±0.21)%和兩者均補(bǔ)充培養(yǎng)液(7.20±0.29)%相比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而五組培養(yǎng)液培養(yǎng)的肝癌Hep3B、Huh7和PLC/5細(xì)胞的sub G1凋亡率差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.顯微鏡下二甲雙胍無(wú)葡萄糖培養(yǎng)液組培養(yǎng)的肝癌Huh7細(xì)胞48h后數(shù)量明顯減少,密度降低;4.二甲雙胍無(wú)葡萄糖培養(yǎng)液組的死亡率為(74.97±0.21)%,與無(wú)葡萄糖培養(yǎng)液組(32.69±0.89)%、二甲雙胍全培養(yǎng)液組(11.98±0.29)%及全培養(yǎng)液組(7.74±0.23)%比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);無(wú)葡萄糖培養(yǎng)液組的死亡率為(32.69±0.89)%,與二甲雙胍全培養(yǎng)液組(11.98±0.29)%及全培養(yǎng)液組(7.74±0.23)%比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.蛋白免疫印跡技術(shù)顯示,二甲雙胍無(wú)葡萄糖培養(yǎng)液組可以觀察到明顯的Caspase-3激活、PARP切割,Mcl-1表達(dá)的降低,以及AKT的磷酸化,自噬相關(guān)蛋白LC3B的減少。結(jié)論:1.葡萄糖缺乏能夠抑制肝癌Hep G2、HCCM細(xì)胞的增殖,促進(jìn)細(xì)胞的凋亡;2.肝癌Hep G2、HCCM細(xì)胞的存活對(duì)葡萄糖缺乏比較敏感,而肝癌Hep3B、Huh7和PLC/5細(xì)胞比較耐受。3.二甲雙胍能促進(jìn)在葡萄糖缺乏條件下肝癌Huh7細(xì)胞的凋亡。4.二甲雙胍能促進(jìn)在葡萄糖缺乏條件下肝癌Huh7細(xì)胞的凋亡可能與AKT磷酸化和自噬有關(guān)。第二章二甲雙胍聯(lián)合2-脫氧-D-葡萄糖對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖和凋亡的影響目的:探討二甲雙胍聯(lián)合葡萄糖拮抗劑2-脫氧-D-葡萄糖對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖和凋亡的影響及其凋亡相關(guān)蛋白的改變。方法:1.不同濃度二甲雙胍全培養(yǎng)液和2-脫氧-D-葡萄糖全培養(yǎng)液培養(yǎng)肝癌細(xì)胞,48h后利用Wst-1試劑觀察肝癌細(xì)胞的增殖情況。2.二甲雙胍和2-脫氧-D-葡萄糖單獨(dú)及聯(lián)合培養(yǎng)肝癌Hep3B、Hep G2細(xì)胞,48h后利用Wst-1試劑觀察肝癌細(xì)胞的增殖情況。3.顯微鏡下觀察二甲雙胍和2-脫氧-D-葡萄糖單獨(dú)及聯(lián)合作用肝癌Hep G2、Hep3B細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。4.利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)全培養(yǎng)液組、二甲雙胍全培養(yǎng)液組、2-脫氧-D-葡萄糖培養(yǎng)液組、二甲雙胍聯(lián)合2-脫氧-D-葡萄糖組培養(yǎng)肝癌Hep G2和Hep3B細(xì)胞48h后的sub G1死亡率;5.運(yùn)用蛋白免疫印跡技術(shù)分析二甲雙胍單獨(dú)及聯(lián)合2-脫氧-D-葡萄糖培養(yǎng)肝癌Hep G2細(xì)胞PARP、Caspase-3及Mcl-1相關(guān)凋亡蛋白的改變。結(jié)果:1.隨著二甲雙胍和2-脫氧-D-葡萄糖的濃度上升,肝癌細(xì)胞Hep G2、HCCM、Hep3B及PLC/5的增殖率下降,呈劑量-反應(yīng)關(guān)系。2.二甲雙胍聯(lián)合2-脫氧-D-葡萄糖組培養(yǎng)的肝癌Hep G2細(xì)胞的存活率為(22.48±0.51)%,與二甲雙胍培養(yǎng)液組(80.68±5.10)%、2-脫氧-D-葡萄糖組(72.56±4.34)%以及對(duì)照組(100.00±5.05)%比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);二甲雙胍聯(lián)合2-脫氧-D-葡萄糖組培養(yǎng)的肝癌Hep3B細(xì)胞的增殖率(29.16±1.34)%,與二甲雙胍培養(yǎng)液組(59.58±1.92)%和對(duì)照組(100.00±1.23)%比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與2-脫氧-D-葡萄糖培養(yǎng)液組(33.87±1.95)%比較,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.二甲雙胍和2-脫氧-D-葡萄糖聯(lián)合處理使得Hep G2細(xì)胞數(shù)量明顯減少,細(xì)胞皺縮、脫落;而聯(lián)合組雖然也造成Hep3B、Huh7細(xì)胞密度降低,但并未顯著增加脫落的死細(xì)胞。4.二甲雙胍聯(lián)合2-脫氧-D-葡萄糖組培養(yǎng)的肝癌Hep G2細(xì)胞的sub G1凋亡率(39.63±0.21)%,明顯高于對(duì)照組(7.12±0.14)%、二甲雙胍組(12.56±0.35)%和2-脫氧-D-葡萄糖組(15.16±1.93)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);Hep3B細(xì)胞聯(lián)合組的凋亡率為(12.58±1.03)%,與對(duì)照組(2.82±0.51)%和二甲雙胍組(8.98±0.86)%比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與2-脫氧-D-葡萄糖組(12.40±1.78)%比較,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.蛋白免疫印跡技術(shù)顯示,聯(lián)合組可以觀察到明顯的Caspase-3激活、PARP切割,以及Mcl-1表達(dá)的降低。結(jié)論:1.二甲雙胍聯(lián)合2-脫氧-D-葡萄糖能進(jìn)一步誘導(dǎo)肝癌Hep G2、HCCM細(xì)胞的凋亡;而聯(lián)合用藥對(duì)肝癌Hep3B細(xì)胞無(wú)明顯誘導(dǎo)凋亡作用。2.二甲雙胍和2-脫氧-D-葡萄糖聯(lián)合對(duì)于肝癌Hep G2細(xì)胞的凋亡作用可能通過(guò)激活Caspase-3有關(guān),并且可能與抗凋亡蛋白Mcl-1的減弱有關(guān)。
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【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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1 Yong Lei;Yanhua Yi;Yang Liu;Xia Liu;Evan T.Keller;Chao-Nan Qian;Jian Zhang;Yi Lu;;Metformin targets multiple signaling pathways in cancer[J];Chinese Journal of Cancer;2017年07期

2 Kris V.Kowdley;;MicroRNAs in Common Human Diseases[J];Genomics, Proteomics & Bioinformatics;2012年05期

3 盧清軍;熊宇;嚴(yán)威;林芬;王效民;吳國(guó)洋;;二甲雙胍對(duì)肝癌細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響[J];中華實(shí)驗(yàn)外科雜志;2011年07期

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本文編號(hào)：2483461