【摘要】：肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,全球每年約有782,000新發(fā)病例。作為病死率第二位的惡性腫瘤,肝癌每年致746,000人死亡,其中一半以上的死亡病例發(fā)生在中國。乙肝病毒(Hepatitis B Virus,HBV)的感染是目前肝癌的主要的危險因素。由于缺乏用于肝癌早期診斷的靈敏特異的生物標志物,肝癌患者常常錯過最佳治療期,臨床預后較差。目前最常見的用于肝癌診斷的生物標志物為甲胎蛋白(Alhpa Feto Protein,AFP),但其在肝癌早期診斷中的價值較為有限。因此,尋找出新型的、高效的生物標志物用于肝癌的早期診斷對于提高肝癌患者的治療效果及預后狀況具有重要意義。近年來的研究發(fā)現(xiàn),微小RNAs(microRNAs,miRNAs)作為一類新型抑癌基因和癌基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移等方面扮演重要角色。成熟的miRNAs通過與其對應的目標mRNA序列結(jié)合,導致mRNA的翻譯受到抑制或者降解,以此來達到調(diào)控目標基因的目的。單獨的一個miRNA分子可參加調(diào)控成百上千的功能各異的目標基因。越來越多的研究結(jié)果表明,來源于靶組織的miRNAs如腫瘤組織的miRNAs,在腫瘤的臨床診斷和預后預測中具有很好的指導作用,是一類重要的候選腫瘤生物標志物。但因靶組織取樣困難以及創(chuàng)傷性等問題,其臨床應用受到局限。2008年,國內(nèi)外多個研究團隊幾乎同時發(fā)現(xiàn)血漿/血清中廣泛存在miRNAs。血漿/血清中的miRNAs不但含量豐富、性質(zhì)穩(wěn)定,而且易于精確定量檢測。其后,循環(huán)mi RNAs作為腫瘤生物標志物具有巨大應用前景這一不爭的事實被多個研究團隊證實。以肝癌為例,目前的循環(huán)minras與肝癌相關性的研究已經(jīng)闡明了一些mirnas的重要意義,但是不同研究結(jié)果之間存在著異質(zhì)性。這些結(jié)果不一致的原因主要與樣本收集和處理過程,檢測的平臺以及數(shù)據(jù)標化的方法不一致有關,也與不同危險因素的暴露存在關聯(lián)。如國外研究的肝癌患者主要是hcv陽性的肝癌患者,但是中國地區(qū)主要的研究對象則為hbv陽性的肝癌患者。此外,國內(nèi)也有利用血漿篩選出在肝癌患者中表達異常的mirnas作為早期診斷標志物的研究,但是由于沒有組織篩選,無法追溯mirnas的來源。為進一步闡明起源于肝臟組織并且能夠區(qū)分hbv感染者與hbv陽性肝癌的,在中國人群中具有肝癌早期診斷價值的循環(huán)mirnas,我們設計了一個多中心的三階段研究。第一階段:利用taqman低密度表達芯片(taqmanlowdensityarray,tlda),1.組織樣本:(1)分別檢測hbv陽性的肝癌患者的肝癌組織、癌旁組織以及hbv陽性的肝炎肝硬化患者的肝炎組織(4例hbv陽性的肝癌病例和1例肝炎肝硬化病例)中mirnas的表達譜,通過兩兩比較差異表達的mirnas,即為組織中與肝癌相關的mirnas;2.血漿樣本:(1)分別檢測hbv陽性的肝癌患者術前的血漿與hbv陽性的肝炎肝硬化患者術前血漿中的mirnas的表達譜,篩選出與肝癌相關的mirnas(4例hbv陽性的肝癌患者術前血漿和1例肝炎肝硬化患者術前血漿);(2)分別檢測hbv陽性的肝癌患者術前血漿與hbv陽性的肝癌患者術后血漿(4例hbv陽性的肝癌病例術前血漿與1例hbv陽性的肝癌病例切除術后血漿)中的mirnas表達譜,篩選出肝臟起源的mirnas;(3)分別檢測hbv陽性的肝癌患者肝癌移植術前的血漿與移植術后血漿(3例hbv陽性的肝癌患者肝癌移植術前和移植術后的血漿)中的mirnas的表達譜,將在肝臟移植術后患者血漿中表達上調(diào)的mirnas剔除;通過上述策略,最終篩選出由肝臟起源的,與肝癌相關的10個循環(huán)mirnas(mir-19a-3p、mir-19b-3p、mir-20a-5p、mir-25-3p、mir-30a-5p、mir-92a-3p、mir-132-3p,mir-185-5p、mir-320a和mir-324-3p)(在肝癌或?qū)φ罩斜磉_ct值低于35,且表達差異4倍以上)。第二階段:通過對單個血漿樣本(患者/對照)進行實時定量pcr(rt-pcr)檢測10個mirnas的表達情況,驗證初篩的mirnas;分為兩個部分(1)第一部分:在35例hbv陽性的肝癌患者及在年齡與性別匹配的50例hbv感染者的血漿中檢測mirna表達水平,發(fā)現(xiàn)上述的10個mirnas在hbv陽性的肝癌患者血漿中表達水平均高于對照組(p0.05),由于其中四個mirnas(mir-19a-3p、mir-19b-3p、mir-20a-5p和mir-92a-3p)均位于腫瘤mirna17-92簇中,且兩個mirnas(mir-19a-3p和mir-19b-3p)與mir-20a-5p存在顯著相關。因此,在第二部分僅檢測了8個mirnas(mir-20a-5p、mir-25-3p、mir-30a-5p、mir-92a-3p、mir-132-3p、mir-185-5p、mir-320a和mir-324-3p)(2)第二部分:在32例hbv陽性的肝癌患者及32例hbv感染者的血漿中檢測8個mirnas的表達水平,檢測發(fā)現(xiàn)這8個mirnas在hbv陽性的肝癌患者血漿中的表達水平均顯著高于對照組(所有p0.05)。為了進一步評價上述8個mirnas在肝癌診斷中的應用價值,我們基于上述樣本(即35例hbv陽性的肝癌患者和50例hbv感染者)進行參數(shù)估計,根據(jù)受試者工作特征曲線(receiveroperatorcharacteristiccurve,roc)來確定各個mirna的最佳診斷界值,在確認最佳診斷臨界值后,進行風險評分(s=0/1).根據(jù)logistic回歸分析的回歸方程中的回歸系數(shù)來確定各個mirna在mirnas組合中的權重,以風險評分為基礎以及各自對應的mirna權重來對每例樣本的危險分值(rsf)進行估計。結(jié)果顯示,上述的8個mirnas組合的auc為0.823(靈敏度82.9%,特異度74.0%)。然后,應用第二階段第一部分確定的最佳診斷界值在第二階段的第二部分樣本中評價了8個mirnas的診斷價值,該階段的結(jié)果顯示8個mirnas組合的auc為0.780(靈敏度78.1%,特異度68.7%);兩部分合并的auc為0.802(靈敏度86.6%,特異度74.0%)。第三階段:為了探討篩選出的mirna是否具有早期診斷的價值,我們進行了巢式病例對照研究。兩個前瞻性隊列分別位于江蘇常州以及江蘇啟東。其中江蘇常州隊列,截止2013年11月,有20例hbv陽性的肝癌患者,我們在隊列中選取了基線資料匹配的40例hbv感染者為對照;江蘇啟東隊列截止2003年12月,有667例HBV陽性的肝癌患者,隨機選取其中50例作為病例組,在未發(fā)病HBV感染者中隨機選取37人作為對照。在上述總計147例樣本中檢測了11個miRNAs的表達情況(8個miRNAs以及文獻報道且與我們TLDA芯片篩選結(jié)果方向一致的3個miRNAs分別為miR-192-5p、miR-21-5p和miR-375)。采用meta分析合并兩個隊列的數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)其中4個miRNAs(mi R-20a-5p、miR-320a、miR-324-3p和miR-375)在肝癌患者中的表達水平顯著高于對照(Pmeta0.05)。為了進一步評價篩選出的這4個miRNAs(mi R-20a-5p、mi R-320a、miR-324-3p和miR-375)在肝癌早期診斷中的價值。我們聯(lián)合AFP結(jié)果,在常州隊列和啟東隊列中分別利用ROC曲線確定每一個miRNAs及AFP的最佳臨界值,然后對每一個個體的表達值進行風險評分,同樣利用ROC曲線確定最佳臨界值,以最佳臨界值為依據(jù)將個體評為危險1或者不危險0。使用Logistic回歸分析對每個miRNA與肝癌發(fā)病的關聯(lián)進行評估。我們發(fā)現(xiàn),4個mi RNAs在常州隊列中的AUC為0.768(靈敏度65.0%,特異度77.5%,陽性預測值59.1%,陰性預測值81.6%),AFP的AUC為0.575(靈敏度15.0%,特異度100.0%,陽性預測值100.0%,陰性預測值70.2%);miRNAs與AFP合并的AUC為0.789(靈敏度70.0%,特異度77.5%,陽性預測值60.9%,陰性預測值83.3%);在啟東隊列中,4個miRNAs的AUC為0.706(靈敏度56.0%,特異度83.3%,陽性預測值82.4%,陰性預測值58.5%),AFP的AUC為0.579(靈敏度16.0%,特異度100.0%,陽性預測值100.0%,陰性預測值46.8%);miRNAs與AFP合并的AUC為0.767(靈敏度64.0%,特異度83.8%,陽性預測值84.2%,陰性預測值63.3%)。本次研究利用肝臟組織與血漿樣本共同篩選,得到來源于肝臟且與肝癌相關的10個血漿miRNAs。在肝癌的診斷方面,我們發(fā)現(xiàn)其中8個miRNAs在HBV陽性的肝癌患者中顯著高表達,通過評估診斷價值后,發(fā)現(xiàn)這8個血漿miRNAs具有較好的診斷價值。在早期診斷方面的,通過巢式病例-研究對照研究,在兩個獨立的隊列中驗證得到4個具有早期肝癌診斷價值的血漿miRNAs。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7
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本文編號：
2483359
