【摘要】：研究背景慢性粒細胞白血病(Chronic Myeloid Leukemia, CML),是由BCR-ABL融合基因引起的造血干細胞疾病。所有的慢粒均具有Ph染色體,即特異性的t(9；22)(q34；q11)核型。BCR-ABL融合基因編碼的p210BCR-ABL蛋白具有極強的酪氨酸激酶活性,它將使一系列信號蛋白發(fā)生持續(xù)性磷酸化,影響細胞的增殖分化、凋亡及黏附,導致慢粒的發(fā)生。因此,BCR-ABL融合基因被認為是慢粒發(fā)病的分子基礎,也是慢粒診斷、療效觀察、預后等的監(jiān)測指標。慢性粒細胞白血病根據(jù)臨床特征和實驗室檢查可分為三個階段：慢性期,加速期和急變期,急變期是慢性粒細胞白血病進程的最后階段,其表現(xiàn)類似急性白血病,進展迅速、生存期較短。目前的觀點認為,BCR-ABL融合基因在慢粒的啟動過程中起著重要作用,而后續(xù)繼發(fā)性分子和遺傳學異�？赡軐е翪ML急變期的進展。然而慢粒急變期進展的確切分子機制迄今仍不十分清楚,因此鑒定出控制慢粒從慢性期向急變期轉變的分子開關顯得尤為重要。以往系列研究已經表明,慢性粒細胞白血病從慢性期到急變期的進展需要大量白血病干細胞(Leukemia stem cells, LSCs)的自我復制,但有關慢性粒細胞白血病急變的關鍵驅動因子目前依然未知。我們以往的研究證實,鈣調蛋白依賴性激酶Ⅱγ(CaMKⅡγ),是小檗胺清除伊馬替尼耐藥的慢性粒細胞白血病干細胞的一個關鍵靶分子,它在白血病細胞增殖中的多個信號通路起了關鍵調節(jié)作用。這一新的發(fā)現(xiàn)提示我們CaMKⅡγ可能參與了慢粒急變的分子機制。研究內容與結果1.CaMKⅡγ在慢粒急變和白血病干細胞的自我更新中的作用為了確定CaMKⅡγ是否在CML急變的發(fā)展中起作用,我們首先關注了CaMKⅡγ缺失對BCR-ABL誘導的小鼠CML模型的影響。CaMKⅡγ/-CML小鼠的外周血白細胞數(shù)量較WT組低得多,其存活時間顯著延長。這一結果表明,CaMKⅡγ基因缺失會顯著抑制CML進展,改善CML小鼠的存活。白血病干細胞在維持CML急變的關鍵作用促使我們研究CaMKⅡγ對CML的LSCs在體內作用的效果。我們檢測了移植25天后CML小鼠骨髓和脾臟中CML LSC和正常造血干細胞的數(shù)量。流式細胞儀檢測數(shù)據(jù)顯示,CaMKⅡγ缺失組骨髓和臆臟中的LSC水平降低了21.5倍和5.1倍,但對正常HSC的影響不大。這些結果表明,CaMKⅡγ對LSCs的自我更新和復制是必需的。2.CaMKⅡγ在人慢粒白血病細胞克隆和CD34陽性細胞增殖中的作用為了確定CaMKⅡγ在人慢性粒細胞白血病細胞克隆形成中的作用,我們下調了人慢性粒細胞白血病急變細胞系K562細胞CaMKⅡγ的表達,結果顯示,CaMKⅡγ特異性shRNA明顯抑制了K562細胞的克隆形成能力。同時,CaMKⅡγ過表達導致的細胞克隆比對照組要大,白血病細胞有絲分裂的數(shù)目也比對照組顯著增加。這些結果意味著,CaMKⅡγ可以通過促進白血病干細胞的自我更新來增強白血病細胞的集落形成能力。為了驗證這一假設,我們接下來關注了CaMKⅡγ對K562細胞CD34表達水平的影響,結果顯示,CaMKⅡγ的過表達顯著增加了K562細胞CD34+細胞的數(shù)量,而下調CaMKⅡγ后,K562細胞CD34+細胞的數(shù)量減少,這表明CaMKⅡγ在白血病細胞的集落形成能力和CD34+細胞的自我復制中具有重要作用。3.CaMKⅡγ的異常激活與腫瘤的生長、進展和總生存率有關為了評估CaMKⅡγ在體內是否促進人類慢性粒細胞白血病的進展,我們構建了兩種人慢粒急變異種移植瘤動物模型,一種是使用CaMKⅡγ高表達(K562/ ADR)構建的,另外一種是用CaMKⅡγ低表達(K562)所構建,然后比較了荷瘤老鼠腫瘤的生長和腫瘤的生存率。與體外實驗觀察一致,我們觀察到,CaMKⅡγ高表達組顯示出較高的腫瘤生長速率和更快的體重下降程度。另外,CaMKⅡγ表高達組的荷瘤小鼠組生存期顯著縮短。這些結果表明CaMKⅡγ可能促進CML急變的進展。為了進一步驗證在CML原代樣本中的表達,我們接下來檢測了CaMKⅡγ是否在人慢性粒細胞白血病的進展過程中異�；罨�。我們使用免疫印跡法檢測了15個慢性期(CP),12個加速期(AP)和19個急變期(BC)原代樣本中磷酸化CaMKⅡγ的表達,結果發(fā)現(xiàn)：在慢性粒細胞白血病急變期和加速期磷酸化CaMKⅡγ異常高表達,但在慢性期表達量低或不表達。為了確定CaMKⅡγ在CML急變中的異�；罨欠衽cCML的LSCs相關聯(lián),我們還同時檢測了一個公認的CML LSC自我更新中關鍵的調節(jié)分子β-catenin的表達水平。結果表明,CaMKⅡγ的表達與慢性粒細胞白血病患者樣本中β-catenin的水平呈正相關,這表明CaMK Ⅱγ可能在β-catenin介導的LSC自我更新中發(fā)揮了重要作用。因此,高度活化的CaMKⅡγ的確參與CML慢性期到加速和急變期的進程。4.CaMKⅡγ通過降低細胞核p27kip1的表達導致慢粒急變?yōu)榱岁U明CaMKⅡγ導致慢粒急變的分子機制,我們接下來檢測CaMKⅡγ表達是否對細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑p27Kip1(p27蛋白)發(fā)生作用,p27在維持干細胞靜止中是個關鍵的制動分子。結果表明,CaMKⅡγ的過表達顯著增強了磷酸化p27(T187)蛋白水平,并降低細胞核p27的積聚。在293-T細胞轉染了EGFP-CaMKⅡγ質粒后也觀察到了類似的結果。這些數(shù)據(jù)表明,CaMKⅡγ通過磷酸化的p27,反過來通過蛋白酶體依賴性降解降低細胞核p27蛋白的表達。為了獲得生化證據(jù),我們進行了免疫共沉淀實驗。從K562細胞分離的總蛋白,分別用flag-CaMKⅡγ抗體或磷酸化的p27抗體進行免疫共沉淀,通過SDS-PAGE,并用與對p27的抗體或標記抗體或CaMKⅡγ抗體進行Western印跡法分析。正向反向結果均證實,p27蛋白和CaMKⅡγ蛋白都存在于免疫沉淀復合物中。為了驗證這些結果,我們關注了CaMKⅡγ過表達對靜止期細胞的影響。結果顯示,CaMKⅡγ過表達增加了有絲分裂期的細胞,靜止細胞(Go/G1期)從43.9%減少到36.1%,而增殖期細胞(S+G2/M)從52.7%增加至62.2%,表明CaMKⅡγ可以通過終止p27介導的細胞靜息期,使白血病細胞進入增殖期。為了進一步證實CaMKⅡγ在白血病細胞中的作用,我們分析了該激酶的亞細胞定位,并發(fā)現(xiàn)CaMKⅡγ蛋白在細胞周期的不同階段中的表達水平是不同的。CaMKⅡγ存在于休眠細胞(G0期),但一旦細胞進入增殖狀態(tài),CaMKⅡγ蛋白表達水平顯著增加,高峰出現(xiàn)在早期的S/G2期細胞,然后下降。這些結果表明,CaMKⅡγ可能在兩個細胞周期Go-G1和S-G2/M起促進作用,這表明,CaMKⅡγ在促進CML細胞的生長過程中發(fā)揮重要作用。總之,我們已經確定CaMKⅡγ在慢粒急變中的重要作用。在我們的研究結果的基礎上,我們推斷,慢性粒細胞白血病是由BCR-ABL融合基因導致,但從慢性期為急變期可能通過CaMKⅡγ的異常活化促進白血病干細胞的自我更新和復制來實現(xiàn)的。此外,CaMKⅡγ通過磷酸化p27蛋白(T187),降低了細胞核p27的表達水平,并重新激活休眠期的白血病干細胞。因此,CML急變需要CaMKⅡγ的異�；罨�。針對CaMKⅡγ可能代表了一種新的診斷和治療CML的方法。結論1.CaMKⅡγ的異�；罨龠M了白血病干細胞的自我更新與復制,在慢性粒細胞白血病從慢性期到急變期中發(fā)揮重要作用。2.CaMKⅡγ通過磷酸化p27,降低細胞核p27的表達水平,重新激活休眠期的白血病干細胞。3.CaMKⅡγ通過促進細胞周期的G0-G1期和S-G2/M期過渡來促進慢粒細胞生長。4.CaMKⅡγ可能成為一種診斷和治療慢性粒細胞白血病的新靶點。
[Abstract]:Background Chronic myeloid leukemia (CML) is a hematopoietic stem cell disease caused by BCR-ABL fusion gene. All the slow particles have the Ph chromosome, that is, the specific t (9;22) (q34; q11) karyotype. The p210BCR-ABL protein encoded by the BCR-ABL fusion gene has strong tyrosine kinase activity, which will cause persistent phosphorylation of a series of signal proteins, which can affect the proliferation and differentiation, apoptosis and adhesion of the cells, and lead to the occurrence of slow particles. Therefore, the BCR-ABL fusion gene is thought to be the molecular basis of the pathogenesis of slow-grain, and it is the monitoring index of slow-grain diagnosis, curative effect observation and prognosis. Chronic myeloid leukemia can be divided into three stages according to the clinical features and laboratory tests: the chronic stage, the acceleration phase and the acute phase, and the acute stage is the last stage of the chronic granulocytic leukemia process, which is similar to the acute leukemia, the progress is rapid, and the survival time is short. The present point of view is that the BCR-ABL fusion gene plays an important role in the initiation of CML, and the follow-up secondary and genetic abnormalities may lead to the progress of the acute phase of CML. However, the exact molecular mechanism of the progress of the slow-grain phase transition is still not clear so far, so it is very important to identify the molecular switches that control the transition of the slow-grain from the chronic stage to the acute stage. The past series of studies have shown that the progression of chronic myeloid leukemia from chronic to acute phase requires self-replication of a large number of leukemia stem cells (LSCs), but the key drivers of the acute change in chronic myeloid leukemia are still unknown. Our previous studies have confirmed that calmodulin-dependent kinase II (CaMK鈪，

本文編號：2480818