發(fā)布時間：2019-05-18 05:23

【摘要】：食管癌是世界上常見的第八大惡性腫瘤,目前中國食管癌發(fā)病率為19.34/10萬,在癌癥新發(fā)病例構(gòu)成中位居第6位,占全部癌癥發(fā)病的7.27%。食管癌死亡率為15.39/10萬,占全部癌癥死亡總數(shù)的8.96%,在癌癥死亡原因中列第4位。根據(jù)食管癌的組織學(xué)特點(diǎn)可分為五種類型,其中食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)所占比例最多,大約占90%,食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EA)次之,占7%左右,其他幾種類型均少見。由于早期癥狀不明顯,缺乏及時發(fā)現(xiàn)和早期診斷的有效方法,臨床上首次確診的食管鱗癌患者80%以上為中、晚期,其5年生存率不及20%,預(yù)后極差。因此,對患者進(jìn)行早診斷、早治療以及尋找診斷食管癌有效的分子生物學(xué)標(biāo)記意義重大。微小RNA(micro RNA,mi RNA,mi R)是一類長度為19-24個核苷酸的單鏈非編碼小分子RNA,通過與靶基因的3’UTR區(qū)特異性結(jié)合抑制靶基因m RNA翻譯或?qū)⑵浣到?從而在轉(zhuǎn)錄后水平起到基因沉默效應(yīng),參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生理功能,且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等密切聯(lián)系。Mi R-1由mi R-1-133表達(dá)簇編碼,其分別位于第18(18q11)和20(20q13)常染色體上,為成熟mi R-1和mi R-133編碼。mi R-1最初作為肌特異性mi RNA在心肌和骨骼肌中發(fā)現(xiàn),參與心肌和骨骼肌的生成。最近研究發(fā)現(xiàn),mi R-1在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的作用。研究表明,mi R-1在多種腫瘤中異常表達(dá),如在結(jié)腸癌、膀胱癌與腎癌中都表達(dá)下調(diào),發(fā)揮抑癌基因的作用,但其表達(dá)與食管鱗癌臨床病理資料及其可能作用機(jī)制的研究少有報(bào)道。有多項(xiàng)研究證實(shí),肌動蛋白骨架蛋白1(LIM和SH3蛋白1,LIM and SH3 protein 1,LASP1)和肌動蛋白結(jié)合蛋白2(Transgelin-2,曾譯為轉(zhuǎn)膠蛋白)在多種惡性腫瘤的增殖、侵襲和發(fā)展過程中起非常重要作用,并證明他們是mi R-1的靶基因,而此兩種癌基因在食管鱗癌方面的研究少見報(bào)道且其與mi R-1在食管鱗癌中的關(guān)系也未見報(bào)道。本研究采用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction,q RT-PCR)檢測mi R-1在食管鱗癌組織和其配對正常組織中的表達(dá),深入分析mi R-1的表達(dá)水平與食管鱗癌患者臨床病理關(guān)系。同時進(jìn)行mi R-1的過表達(dá)或沉默,并通過MTT實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡和周期、Transwell實(shí)驗(yàn),研究其對食管鱗癌細(xì)胞株Eca109增殖、凋亡和周期、遷移和侵襲能力的影響,利用雙熒光素酶報(bào)告基因分析檢測mi R-1對其預(yù)測靶基因LASP1和TAGLN2的靶向作用。同時檢測食管鱗癌組織和其配對正常組織中LASP1和TAGLN2的表達(dá)情況,分析其與mi R-1表達(dá)水平的關(guān)系。并在最后探討了血漿mi R-1作為腫瘤標(biāo)記物的可能性。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:第一部分mi R-1、LASP1和TAGLN2在食管鱗癌中的表達(dá)及其與臨床病理特征關(guān)系的研究目的:通過檢測mi R-1、LASP1和TAGLN2在食管鱗癌組織和配對正常組織中的表達(dá),探討其在食管鱗癌中的表達(dá)情況及其與食管鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系。方法:采用q RT-PCR技術(shù)檢測mi R-1在55例食管鱗癌組織和配對正常組織中的表達(dá),回顧性分析其表達(dá)水平與食管鱗癌患者的臨床病理特征關(guān)系。食管鱗癌患者的臨床病理特征包括患者年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤TNM分期、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及脈管瘤栓情況等。選擇與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的癌基因LASP1和TAGLN2,分別采用q RT-PCR和免疫組織化學(xué)法檢測其在食管鱗癌組織和配對正常組織的表達(dá)水平,探討其表達(dá)水平與食管鱗癌患者的臨床病理特征關(guān)系。另外,分析了mi R-1與癌基因LASP1和TAGLN2的相關(guān)性。結(jié)果:1 mi R-1在食管鱗癌組織和配對正常組織中的表達(dá)水平。應(yīng)用q RT-PCR檢測55例食管鱗癌組織和配對正常組織中mi R-1的表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),食管鱗癌組織中mi R-1的表達(dá)水平低于相應(yīng)的癌旁正常組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2 mi R-1的表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理特征間的關(guān)系。55例食管鱗癌患者中,mi R-1的相對表達(dá)水平與食管鱗癌患者的年齡、性別、腫瘤位置和腫瘤大小無明顯關(guān)系(P0.05),而與食管鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級和脈管瘤栓等有關(guān)(P=0.002,P=0.000,P=0.022)。3 LASP1和TAGLN2在食管鱗癌組織和配對正常組織中的表達(dá)水平。采用q RT-PCR和免疫組化法檢測與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的癌基因LASP1和TAGLN2在55例食管鱗癌組織和配對正常組織中的表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),食管鱗癌組織中LASP1和TAGLN2的表達(dá)水平顯著高于相應(yīng)的癌旁正常組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4 LASP1和TAGLN2的表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理特征間的關(guān)系。55例食管鱗癌患者中,LASP1和TAGLN2的相對表達(dá)水平與食管鱗癌患者的年齡、性別、腫瘤位置和腫瘤大小無明顯關(guān)系(P0.05),而與食管鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級和脈管瘤栓等有關(guān)(P=0.000,P=0.000,P=0.008和P=0.000,P=0.001,P=0.008)。5食管鱗癌組織中mi R-1與LASP1和TAGLN2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。經(jīng)Spearman秩相關(guān)性檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn),在LASP1低表達(dá)的食管鱗癌組織標(biāo)本(24例)中,mi R-1高表達(dá)的標(biāo)本占66.7%(16例/24例);而LASP1高表達(dá)的標(biāo)本(31例)中,mi R-1低表達(dá)的標(biāo)本占87.1%(27例/31例);mi R-1與LASP1蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.45,P0.05)。在TAGLN2低表達(dá)的食管鱗癌組織標(biāo)本(24例)中,mi R-1高表達(dá)的標(biāo)本占50.0%(12例/24例);而TAGLN2高表達(dá)的標(biāo)本(31例)中,mi R-1低表達(dá)的標(biāo)本占74.2%(23例/31例);mi R-1與TAGLN2蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.382,P0.05)。結(jié)論:1 mi R-1在食管鱗癌組織中表達(dá)顯著低于配對正常組織,而LASP1和TAGLN2在食管鱗癌組織中表達(dá)顯著高于配對正常組織。2 mi R-1、LASP1和TAGLN2在食管鱗癌組織中的表達(dá)與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級和脈管瘤栓等有關(guān)。3 mi R-1與癌基因LASP1和TAGLN2存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系,提示mi R-1可能在食管鱗癌的侵襲轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮重要作用。第二部分mi R-1對食管鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響的體外實(shí)驗(yàn)研究目的:研究mi R-1對于食管鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和周期、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。方法:體外轉(zhuǎn)染mi R-1模擬物或是抑制物或其陰性對照,通過MTT、流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)在體外觀察mi R-1在食管鱗癌細(xì)胞Eca109增殖、凋亡和周期、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮的作用。結(jié)果:1 mi R-1對食管鱗癌細(xì)胞株Eca109細(xì)胞增殖能力的影響。MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示,食管鱗癌細(xì)胞在24 h、48 h、72 h細(xì)胞增殖率mimics-mi R-1組與mimics-mi R-1 control組比較降低,而inhibitor-mi R-1組與inhibitor-mi R-1 control組比較增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),表明mi R-1對食管鱗癌細(xì)胞增殖具有抑制作用。2 mi R-1對人食管鱗癌細(xì)胞株Eca109細(xì)胞凋亡與周期的影響。流式細(xì)胞技術(shù)檢測結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)染48h后,mimics-mi R-1組與mimics-mi R-1 control組比較和inhibitor-mi R-1組與inhibitor-mi R-1 control組比較,Eca109細(xì)胞在凋亡率和細(xì)胞周期方面未發(fā)生明顯變化,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3 mi R-1對人食管鱗癌細(xì)胞株Eca109細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響。Transwell分析結(jié)果顯示,mimics-mi R-1組與mimics-mi R-1 control組相比,mimics-mi R-1組Eca109細(xì)胞遷移和侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)明顯少于mimics-mi R-1 control組(P0.05),說明其遷移和侵襲能力明顯減弱;inhibitor-mi R-1組與inhibitor-mi R-1 control組比較,inhibitor-mi R-1組Eca109細(xì)胞下室的細(xì)胞數(shù)明顯增多,說明其遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,說明mi R-1基因能夠影響Eca109細(xì)胞的遷移和侵襲能力。結(jié)論:mi R-1可抑制食管鱗癌細(xì)胞Eca109的增殖、遷移和侵襲能力,而對細(xì)胞凋亡和周期無影響。第三部分mi R-1調(diào)控LASP1和TAGLN2表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究目的:探討食管鱗癌中mi R-1對于LASP1和TAGLN2表達(dá)的相關(guān)調(diào)控關(guān)系。方法:運(yùn)用Micro RNA生物信息學(xué)網(wǎng)站和軟件,對其可能的作用靶序列進(jìn)行預(yù)測分析,結(jié)合mi R-1在食管鱗癌細(xì)胞中發(fā)揮的生物學(xué)功能,進(jìn)行進(jìn)一步篩選。通過雙熒光素酶報(bào)告基因分析的方法檢測mi R-1對其預(yù)測靶基因LASP1和TAGLN2的靶向作用,采用Western-blot驗(yàn)證食管鱗癌細(xì)胞株Eca109中mi R-1對其預(yù)測靶基因表達(dá)的影響。結(jié)果:1生物信息學(xué)軟件預(yù)測靶基因,并雙熒光素酶驗(yàn)證mi R-1對LASP1和TAGLN2的靶向作用。生物信息學(xué)軟件Target Scan預(yù)測結(jié)果提示,mi R-1序列可以分別與LASP1和TAGLN2 m RNA的3’-UTR區(qū)相結(jié)合,其兩者可能為mi R-1的靶基因。我們進(jìn)一步通過雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測了mi R-1與LASP1和TAGLN2基因m RNA 3’-UTR區(qū)結(jié)合位點(diǎn)的活性。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染mimics-mi R-1后能夠顯著降低食管鱗癌細(xì)胞Eca 109中LASP1和TAGLN2的相對熒光強(qiáng)度,分別是對照組轉(zhuǎn)染了mimics-mi R-1 control的42%和31%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),提示LASP1和TAGLN2是mi R-1的下游調(diào)控靶分子,mi R-1與LASP1和TAGLN2的3’-UTR結(jié)合后對它們進(jìn)行負(fù)性調(diào)控。2在食管鱗癌細(xì)胞株Eca109中過表達(dá)mi R-1對LASP1和TAGLN2蛋白表達(dá)的影響Western blot檢測mi R-1轉(zhuǎn)染48 h后,實(shí)驗(yàn)組及對照組靶基因LASP1和TAGLN2蛋白表達(dá)變化。結(jié)果顯示,mimics-mi R-1組的LASP1和TAGLN2蛋白表達(dá)水平低于其對應(yīng)mimics-mi R-1 control組,而inhibitor-mi R-1組的LASP1和TAGLN2蛋白表達(dá)水平高于其對應(yīng)inhibitor-mi R-1 control組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論:1 mi R-1可以通過與LASP1和TAGLN2的m RNA 3’-UTR區(qū)結(jié)合抑制其表達(dá),證明LASP1和TAGLN2是mi R-1的靶基因。2在食管鱗癌患者中mi R-1可能是通過LASP1和TAGLN2途徑調(diào)控食管鱗癌的發(fā)展。第四部分血漿mi R-1作為食管鱗癌腫瘤標(biāo)志物的潛在診斷價(jià)值的研究目的:研究食管鱗癌患者外周血中mi R-1的表達(dá)情況,探討其在食管鱗癌診斷中的應(yīng)用。方法:采集23例初治食管鱗癌患者及11例體檢健康人的血漿標(biāo)本,提取RNA后采用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction,q RT-PCR)檢測血漿mi R-1表達(dá)水平,分析其與食管鱗癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系;同時比較其中10對術(shù)前和術(shù)后7~10 d食管鱗癌患者手術(shù)前后mi R-1表達(dá)水平的變化;繪制受試者工作特征曲線并分析其診斷食管鱗癌的價(jià)值。結(jié)果:1食管鱗癌患者和健康對照組血漿中mi R-1的表達(dá)水平。應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR檢測食管鱗癌組與健康對照組血漿中mi R-1的表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),食管鱗癌患者比對照組健康人血漿中mi R-1的表達(dá)顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。2血漿mi R-1在食管鱗癌患者手術(shù)前后表達(dá)變化。食管鱗癌患者術(shù)后7-10 d外周血中mi R-1的表達(dá)水平較術(shù)前顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。3血漿mi R-1表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理特征間的關(guān)系。血漿mi R-1的相對表達(dá)水平與食管鱗癌患者年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤大小均無明顯相關(guān)性(P0.05);但與淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P=0.005);與組織學(xué)分級呈負(fù)相關(guān),但統(tǒng)計(jì)學(xué)無差異(P=0.083)。4血漿mi R-1在食管鱗癌診斷中的價(jià)值。以23例食管鱗癌患者及11例健康對照者血漿mi R-1的相對表達(dá)量繪制ROC曲線,分析顯示,通過檢測血漿mi R-1水平來區(qū)分健康人和食管鱗癌患者的曲線下面積是0.881[95%的置信區(qū)間(confidence interval,95%CI):0.743-1],臨界值取0.688時,其特異度87%,靈敏度81.8%(P0.01)。結(jié)論:1血漿mi R-1在食管鱗癌患者中的表達(dá)明顯下調(diào),且食管鱗癌術(shù)后mi R-1表達(dá)上調(diào)。2血漿mi R-1有望成為用于食管鱗癌篩查的新型分子標(biāo)志物。
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【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2479718