【摘要】：近年來盡管胃癌的發(fā)病率有所降低,但是其依舊是世界上患者最多的癌癥之一。在發(fā)展中國家中,胃癌是致死率最高的三種癌癥之一,每年約有十萬胃癌新生病人。雖然我們在胃癌的放化療方面取得了極大的進步,但是胃癌病人的預(yù)后情況依舊不理想,平均五年的生存率不到30%。因此,篩選有效的胃癌藥物,對于提高胃癌病人的治療效果及生存率擁有非凡的意義。黃酮類化合物包括黃酮、黃烷酮、異黃酮、二氫異黃酮、二氫查爾酮等幾大類,據(jù)報道黃酮類化合物具有抗腫瘤活性。比如,黃芩素作為一種派生類黃酮,擁有多種不同的生物活性,其可以誘導(dǎo)膀胱癌的凋亡,同時還可以抑制非小細胞肺癌細胞的增殖。另外黃酮前體查爾酮可以通過抑制NF-κB的活性從而抑制胃癌細胞的生長,同時可以上調(diào)DR4和DR5的表達,從而引起結(jié)腸癌和肝癌的凋亡。桑辛素作為一種桑白皮(桑樹根部的皮)富含的黃酮類化合物,據(jù)報道其可以通過抑制NF-κB的活性來誘導(dǎo)宮頸癌和結(jié)腸癌的凋亡。同時能夠通過調(diào)節(jié)EGFR及DR5的活性,來誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞的凋亡。不僅如此,同時桑辛素能夠抑制STAT3的活性,從而誘導(dǎo)前列腺癌細胞的死亡。基于目前研究現(xiàn)狀,我們提出假設(shè):桑辛素可以抑制胃癌細胞的細胞增殖和腫瘤生長。通過增殖率分析、western blot、細胞周期分析等實驗,本文發(fā)現(xiàn)桑辛素的確擁有抑制胃癌細胞生長和腫瘤生長的能力。實驗主要結(jié)果如下:1.桑辛素通過將細胞周期阻滯在G1期來抑制胃癌細胞的增殖使用不同濃度的桑辛素對兩種胃癌細胞系(MKN45及SGC7901)進行處理后,細胞增殖率結(jié)果顯示,桑辛素顯著地抑制了胃癌細胞的增殖,同時MTT實驗及BrdU實驗也得到了同樣的結(jié)果。為探索桑辛素抑制胃癌細胞增殖的機制,進行了細胞周期分析,結(jié)果顯示桑辛素可以將胃癌細胞阻滯在G1期。同時為了探索桑辛素阻滯細胞周期的分子機制,通過western blot實驗對細胞周期相關(guān)蛋白表達進行檢測,發(fā)現(xiàn)桑辛素下調(diào)了CDK2,CDK4,Cyclin D1以及Cyclin E1的表達。以上實驗結(jié)果表明,桑辛素可以下調(diào)細胞周期相關(guān)蛋白的表達,從而抑制胃癌細胞的細胞周期進程及細胞增殖。2.桑辛素可以顯著抑制胃癌細胞的成瘤為探索桑辛素對胃癌細胞體外成瘤的影響,我們進行了Soft Agar實驗,結(jié)果顯示相對于對照組而言,桑辛素處理組克隆數(shù)目較少且體積較小,桑辛素抑制了胃癌細胞體外成瘤。同時進行了小鼠移植瘤實驗,對腫瘤生長情況進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),桑辛素顯著抑制了腫瘤的生長。對各組腫瘤進行免疫組化分析,結(jié)果顯示桑辛素處理組生長標(biāo)志物Ki67陽性細胞率顯著下降。對CDK2,CDK4,Cyclin D1以及Cyclin E1在腫瘤中的表達情況進行分析發(fā)現(xiàn),四種周期蛋白表達均顯著降低。以上實驗結(jié)果表明,無論在體內(nèi)還是體外,桑辛素均可通過阻滯細胞周期來抑制腫瘤的生長。3.桑辛素通過下調(diào)c-Myc的表達來抑制細胞周期相關(guān)蛋白的表達Western blot實驗表明桑辛素可以下調(diào)c-Myc的表達,并且這種下調(diào)作用有時間和濃度的依耐性,免疫組化分析也表明桑辛素可以抑制c-Myc在腫瘤內(nèi)的表達。為了研究c-Myc在桑辛素調(diào)節(jié)細胞增殖中的作用,我們構(gòu)建了c-Myc過表達的胃癌細胞系。對正常的胃癌細胞系和過表達c-Myc細胞系進行藥物處理后,MTT實驗結(jié)果表明,c-Myc可以減緩桑辛素對胃癌細胞增殖的抑制作用。在c-Myc過表達的細胞系中,四種細胞周期蛋白(CDK2,CDK4,Cyclin D1以及Cyclin E1)的表達均有不同程度的上調(diào)。由于c-Myc是通過識別“E-box”序列,從而結(jié)合到靶基因的啟動子上來調(diào)控下游基因的表達,為研究c-Myc是否結(jié)合到CDK2,CDK4,Cyclin D1以及Cyclin E1的啟動子上,我們進行了ChIP實驗。ChIP實驗結(jié)果表明c-Myc可以通過識別“E-box”序列,從而結(jié)合到CDK4,Cyclin D1以及Cyclin E1的啟動子上。雖然CDK2啟動上也存在“E-box”序列,但是我們的結(jié)果并沒有發(fā)現(xiàn)c-Myc可以結(jié)合到CDK2的啟動子。綜上所述,桑辛素通過下調(diào)c-Myc的表達來抑制細胞周期相關(guān)蛋白的表達。4.桑辛素通過下調(diào)c-Myc的表達來抑制細胞周期和腫瘤生長基于我們前期的實驗結(jié)果,我們提出假設(shè):桑辛素通過下調(diào)c-Myc的表達來抑制細胞周期進程。為了驗證我們的假設(shè),在過表達c-Myc和正常的胃癌細胞添加桑辛素處理后,進行細胞周期分析,結(jié)果顯示過表達c-Myc可以顯著降低處于G1期的細胞比例。western blot實驗結(jié)果表明,在桑辛素處理后,過表達c-Myc細胞系相對于對照組而言,CDKs以Cyclins的表達量都相對較高,以上實驗結(jié)果表明,過表達c-Myc可以減緩桑辛素對胃癌細胞細胞周期的阻滯。我們發(fā)現(xiàn)桑辛素可以顯著抑制c-Myc的表達,且原癌基因c-Myc在腫瘤發(fā)生和生長方面發(fā)揮著重要的作用,所以在對過表達c-Myc的細胞系和正常胃癌細胞系進行藥物處理后,在體外我們檢測了各組細胞的成瘤能力,結(jié)果表明過表達c-Myc的細胞系相對于對照組而言,成瘤數(shù)目有顯著的提升。小鼠移植瘤實驗也表明,過表達c-Myc可以減緩桑辛素對腫瘤生長的抑制作用。以上實驗結(jié)果表明桑辛素通過下調(diào)c-Myc的表達來抑制細胞周期和腫瘤生長。綜上所述,通過增殖率檢測、MTT實驗以及BrdU染色,發(fā)現(xiàn)桑辛素可以顯著抑制胃癌細胞的增殖。進一步實驗我們發(fā)現(xiàn)桑辛素通過下調(diào)細胞周期相關(guān)蛋白的表達,將胃癌細胞阻滯在G1期,從而抑制胃癌細胞的增殖,同時桑辛素還可以抑制胃癌細胞的成瘤能力。并且我們發(fā)現(xiàn)桑辛素抑制細胞增殖和成瘤均是通過下調(diào)c-Myc的表達來實現(xiàn)的。由于c-Myc在許多胃癌病人中都存在異常的高表達,且c-Myc的異常高表達往往會導(dǎo)致病人的預(yù)后變差,本研究發(fā)現(xiàn)桑辛素可以顯著抑制原癌基因c-Myc的表達,表明桑辛素擁有成為胃癌治療藥物的潛力。
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【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.2

【參考文獻】

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1 桑建中;劉麗;田芳;金紅軍;袁林林;婁衛(wèi)華;;人喉鱗癌組織中c-myc蛋白的表達及c-myc siRNA下調(diào)喉癌Hep-2細胞中c-myc的表達對細胞增殖的影響[J];臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志;2011年15期

2 Danielle Queiroz Calcagno;Mariana Ferreira Leal;Paulo Pimentel Assumpo;Marília de Arruda Cardoso Smith;Rommel Rodríguez Burbano;;MYC and gastric adenocarcinoma carcinogenesis[J];World Journal of Gastroenterology;2008年39期

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本文編號：2472200