【摘要】：背景與目的轉(zhuǎn)移,即惡性腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位到遠(yuǎn)隔臟器的播散,其導(dǎo)致了90%的人類惡性腫瘤相關(guān)性死亡。從病理上講,轉(zhuǎn)移是一個(gè)包含了一系列離散生物學(xué)事件的多步驟過程。在該過程中,惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲是最為關(guān)鍵的生物學(xué)步驟之一,它參與了從轉(zhuǎn)移起始發(fā)生到形成繼發(fā)腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)性級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的幾乎每一個(gè)階段�；|(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs)是一類包含25個(gè)高度同源性家族成員的鈣離子依賴性含鋅肽鏈內(nèi)切酶。傳統(tǒng)認(rèn)為,基質(zhì)金屬蛋白酶的主要功能是對(duì)細(xì)胞間粘附分子以及細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix, ECM)進(jìn)行降解,從而為惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲浸潤(rùn)提供有利條件。最近,基質(zhì)金屬蛋白酶又被證實(shí)具有獨(dú)立于其蛋白水解活性之外的增強(qiáng)細(xì)胞遷移能力的功能。基質(zhì)金屬蛋白酶-14(Matrix metalloproteinase-14, MMP-14)是一種膜嵌入型基質(zhì)金屬蛋白酶,它能夠通過降解細(xì)胞外基質(zhì)以及基底膜蛋白、激活MMP-2前體以及MMP-13前體、誘導(dǎo)生長(zhǎng)因子激活、增強(qiáng)細(xì)胞遷移能力,從而在惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中扮演十分關(guān)鍵的角色。在表型上,MMP-14對(duì)于促進(jìn)上皮細(xì)胞向可遷移的間充質(zhì)樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化(Epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)也發(fā)揮了至關(guān)重要的作用,該轉(zhuǎn)化被認(rèn)為是轉(zhuǎn)移過程起始步驟的一個(gè)重要機(jī)制。然而,MMP-14在惡性腫瘤進(jìn)展過程中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制仍然有待進(jìn)一步闡明。研究證實(shí),轉(zhuǎn)錄因子Spl和Egr-1能夠上調(diào)MMP-14的表達(dá)水平。MMP-14還被證實(shí)能在轉(zhuǎn)錄水平上受到乏氧誘導(dǎo)因子-2α(Hypoxia-inducible factor-2α,HIF-2α)的調(diào)節(jié)。MMP-14表達(dá)水平不但受到這些轉(zhuǎn)錄因子的正性調(diào)控,它還受到miRNA-9和miRNA-133a等microRNAs(miRNAs,miR)的負(fù)性調(diào)控。microRNAs(miRNAs或miR)為高度保守的非編碼小RNA,其被報(bào)道能夠通過轉(zhuǎn)錄后抑制、信使RNA降解或啟動(dòng)子激活,負(fù)性或正性地調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)從而參與轉(zhuǎn)移過程。盡管miRNAs能夠通過與所調(diào)節(jié)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合正性調(diào)節(jié)基因表達(dá),但絕大多數(shù)niRNAs均被報(bào)道可抑制翻譯或通過與靶信使RNA的3'端非翻譯區(qū)(Three prime untranslated regions,3'UTR)相互作用誘導(dǎo)其發(fā)生序列特異性降解從而負(fù)性調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。miRNAs首先被轉(zhuǎn)錄成大約70個(gè)核苷酸的前體,然后經(jīng)過名為Dicer的核糖核酸酶-Ⅲ型酶(Nase-III type enzyme)處理,得到約為22個(gè)核苷酸的成熟產(chǎn)物。迄今為止,人類基因組已被鑒定出含有超過1500個(gè)niRNAs編碼基因,它們共同調(diào)控著大約30%的人類基因表達(dá)。與此同時(shí),每個(gè)獨(dú)立的miRNA也被證實(shí)能夠調(diào)控?cái)?shù)十至數(shù)百個(gè)基因的表達(dá),從而對(duì)多種細(xì)胞通路進(jìn)行高效的協(xié)調(diào)與整合。有趣的是,許多miRNAs以多成員家族的形式存在,表明了它們功能上的冗余。miR-181a-5p為miR-181s的家族成員,該家族包括了4個(gè)高度保守的成熟miRNA分子,分別為miR-18la、miR-181b、miR-181c和miR-181d.它們獨(dú)立來自6個(gè)miRNA前體,這些miRNA前體的編碼基因位于3條不同的染色體上。最近,這組新的基因被證實(shí)能在惡性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。另一方面,miR-181s家族成員也在許多腫瘤中表達(dá)下調(diào)從而發(fā)揮腫瘤抑制基因的功能。在本研究中,我們證實(shí)了miR-181a-5p能夠通過直接靶定MMP-14信使RNA的3'UTR從而負(fù)性調(diào)節(jié)MMP-14表達(dá),造成細(xì)胞遷移能力、侵襲能力以及血管生成能力的顯著降低。我們的數(shù)據(jù)突出了miR-181a-5p在惡性腫瘤播散過程中的重要功能性角色,揭示了一個(gè)具有預(yù)后意義的潛在生物標(biāo)志物以及預(yù)防惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在分子靶點(diǎn)。材料與方法在第一部分的研究中,我們采用基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)、激光捕獲顯微切割技術(shù)、Real time PCR和免疫組織化學(xué)染色方法,對(duì)MMP-14在來自不同器官的不同惡性腫瘤中的表達(dá)水平以及MMP-14在惡性腫瘤組織(包括浸潤(rùn)前緣的惡性腫瘤細(xì)胞)和癌旁正常組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了系統(tǒng)的檢測(cè)與分析,驗(yàn)證了MMP-14在多種人類惡性腫瘤中的表達(dá)上調(diào)情況,闡明了MMP-14表達(dá)分布與惡性腫瘤細(xì)胞侵襲浸潤(rùn)狀態(tài)之間的相關(guān)性。在第二部分的研究中,我們采用生物信息學(xué)分析、DNA構(gòu)建體構(gòu)建、慢病毒系統(tǒng)、Real time PCR、蛋白免疫印跡和雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)的方法,對(duì)MMP-14的潛在調(diào)節(jié)者進(jìn)行了預(yù)測(cè),證實(shí)了niR-181a-5p能夠干擾異位表達(dá)的MMP-14,且能夠通過直接靶定MMP-14信使RNA的3'UTR從而對(duì)MMP-14的表達(dá)發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用。在第三部分的研究中,我們采用DNA構(gòu)建體構(gòu)建、慢病毒系統(tǒng)、明膠酶譜分析、蛋白免疫印跡、Transwell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、基于圓點(diǎn)的2D細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、基于圓點(diǎn)的3D細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)、大體手工刮取技術(shù)、Real time PCR,細(xì)胞表面生物素酰化實(shí)驗(yàn)、雞胚絨毛尿囊膜侵襲實(shí)驗(yàn)和雞胚絨毛尿囊膜血管生成實(shí)驗(yàn)的方法,探索了miR-181a-5p對(duì)MMP-14功能的影響,證實(shí)了miR-181a-5p能夠抑制MMP-14介導(dǎo)的細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲以及血管生成。結(jié)果1.MMP-14在多種人類惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)人類惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的MMP-14已被證實(shí)能夠促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。盡管MMP-14在多種惡性腫瘤中均被報(bào)道為表達(dá)上調(diào),但迄今為止仍然沒有關(guān)于MMP-14在來自不同器官的不同惡性腫瘤中表達(dá)水平的系統(tǒng)分析。通過挖掘基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)Oncomine (癌癥分析數(shù)據(jù)庫(kù)),我們?cè)u(píng)估了MMP-14在人類惡性腫瘤標(biāo)本中的表達(dá)水平。當(dāng)P值被賦值限定在小于0.01時(shí),相較于各自的非惡性對(duì)照組織,大量的惡性腫瘤展現(xiàn)出了MMP-14的顯著表達(dá)上調(diào)。為了驗(yàn)證數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果,我們檢測(cè)了MMP-14在人類乳腺癌標(biāo)本中信使RNA與蛋白的表達(dá)水平。我們采用本課題組既往使用的激光捕獲顯微切割技術(shù)采集了乳腺癌細(xì)胞和癌旁正常上皮細(xì)胞,然后行Real time PCR檢測(cè)其中的MMP-14信使RNA水平。我們的數(shù)據(jù)表明,MMP-14選擇性地表達(dá)于人類乳腺導(dǎo)管原位癌和浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中,而正常上皮則未見表達(dá)。MMP-14在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的表達(dá)水平高于其在乳腺導(dǎo)管原位癌中的表達(dá)水平,盡管兩者之間的差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為了確認(rèn)這個(gè)現(xiàn)象,我們使用抗-MMP-14抗體對(duì)相應(yīng)的人類乳腺癌標(biāo)本進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色。與Real time PCR的檢測(cè)數(shù)據(jù)相一致,MMP-14蛋白僅在人類乳腺癌細(xì)胞中被檢測(cè)到,而并未在鄰近的正常上皮細(xì)胞中被檢測(cè)出來。為了進(jìn)一步證實(shí)我們數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果所顯示的MMP-14表達(dá)上調(diào)是一個(gè)惡性腫瘤中的普遍現(xiàn)象,我們使用抗-MMP-14抗體對(duì)人類結(jié)腸癌標(biāo)本進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色。我們觀察到MMP-14在正常結(jié)腸粘膜細(xì)胞中表達(dá)量極少,而在位于浸潤(rùn)前緣的惡性腫瘤細(xì)胞中卻呈現(xiàn)了顯著升高的染色強(qiáng)度。因此,我們的研究表明,MMP-14在人類惡性腫瘤中顯著表達(dá)上調(diào),且其表達(dá)水平與惡性腫瘤的侵襲浸潤(rùn)狀態(tài)密切相關(guān)。2. miR-181s被計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)為MMP-14的潛在調(diào)節(jié)者M(jìn)MP-14在人類惡性腫瘤中呈現(xiàn)顯著表達(dá)上調(diào),然而其表達(dá)上調(diào)的調(diào)節(jié)機(jī)制仍然有待進(jìn)一步闡明。當(dāng)我們將包含有MMP-143'UTR的MMP14-GFP嵌合體cDNA (MMP14-GFP/3'-UTR)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至低侵襲性人類乳腺癌細(xì)胞MCF-7和高侵襲性人類乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231時(shí),我們注意到MMP 14-GFP在MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)弱于在MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)。然而這種差異并沒有在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染了不包含MMP-14 3'UTR的MMP14-GFP嵌合體cDNA的細(xì)胞中被觀察到。這個(gè)結(jié)果也可在人類前列腺癌細(xì)胞LNCaP(低侵襲性)、DU145和PC3(高侵襲性)中被重復(fù)出來,提示MMP-14信使RNA 3'UTR可能含有造成MMP-14在不同惡性腫瘤細(xì)胞系中差異表達(dá)的調(diào)控序列。眾所周知,3'UTR通常包含miRNA應(yīng)答元件(miRNA response elements, MRE),這些元件正是rniRNAs能夠與3'UTR相結(jié)合的序列。為了識(shí)別MMP-14信使RNA 3'UTR上假定的miRNA應(yīng)答元件,我們使用TargetScan搜尋其中潛在的miRNA應(yīng)答元件。該分析顯示,MMP-14信使RNA 3'UTR上存在多個(gè)miRNA應(yīng)答元件能夠潛在地與miR-22、miR-24、miR-26、miR-133、miR-150以及miR-181s相互作用。為了增加這些假定的niRNA應(yīng)答元件存在于3'UTR上的概率,我們又使用了另一個(gè)miRNA預(yù)測(cè)算法miRanda.通過對(duì)TargetScan和miRanda所預(yù)測(cè)的miRNA應(yīng)答元件進(jìn)行對(duì)比分析,我們發(fā)現(xiàn)只有miR-133和miR-181s是同時(shí)被兩種計(jì)算機(jī)分析方法預(yù)測(cè)出來的共同結(jié)果。而在該3'UTR的第291個(gè)核苷酸至第297個(gè)核苷酸之間,niR-181的miRNA應(yīng)答元件與miR-181 s相結(jié)合的預(yù)測(cè)得分最高,因此我們選擇了對(duì)miR-181s進(jìn)行進(jìn)一步研究。3.miR-181a-5p能夠干擾異位表達(dá)的MMP-14由于不同亞型的miR-181包含了可與MMP-14 3'UTR結(jié)合的相同種子序列,miR-181a-2連同其兩側(cè)含有140個(gè)堿基對(duì)的側(cè)翼區(qū)被我們從染色體DNA中擴(kuò)增了出來,所獲得的DNA也被我們克隆至包含綠色熒光蛋白報(bào)告基因的MDH1-PGK-GFP 20逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中。基于當(dāng)下的miRNA命名原則(http://www.mirbase.org), 我們將包含hsa-miR-181a-2成熟序列的載體命名為miR-181a-5p/GFP。采用相似的方法,被預(yù)測(cè)為不能與MMP-143'UTR相結(jié)合的miR-128也被我們克隆至MDH1-PGK-GFP 2.0逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中作為對(duì)照(miR-128/GFP)。我們通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染編碼miR-181a-5p/GFP的cDNAs和對(duì)照載體至不表達(dá)可檢測(cè)到的內(nèi)源性MMP-14的COS-1細(xì)胞中,使miR-181a-5p在該細(xì)胞中異位表達(dá)。采用Real time PCR方法,我們檢測(cè)到成熟的miR-181a-5p和miR-128已在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的COS-1細(xì)胞中表達(dá),且與對(duì)照載體相比,miR-181a-5p和miR-128的表達(dá)水平分別達(dá)到了5倍和7倍的升高,表明成熟的miR-181a-5p和miR-128已在受轉(zhuǎn)染細(xì)胞中被高效地生產(chǎn)。隨后, 我們將MMP-14/3'-UTR和miR-control、miR-81a-5p/GFP或miR-128/GFP分別共轉(zhuǎn)染至COS-1細(xì)胞中,檢測(cè)miR-181a-5p能否影響異位表達(dá)的MMP-14。為了增加miRNA和MMP-14/3'-UTR的表達(dá)效率,我們首先在COS-1細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)各個(gè)miRNA,然后再瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MMP-14/3'-UTR cDNAs和對(duì)照載體。異位表達(dá)的miR-181a-5p,而非miR-control或miR-128,導(dǎo)致了MMP-14信使RNA水平和蛋白水平的顯著降低,提示miR-181a-5p能夠下調(diào)MMP-14的信使RNA。為了進(jìn)一步闡明miR-1 81 a-5p所致的MMP-14信使RNA水平和蛋白水平表達(dá)缺失是由于MMP-14 3'-UTR的存在,我們采用過去已合成的僅編碼MMP-14開放閱讀框架但缺少M(fèi)MP-143'UTR的質(zhì)粒DNA對(duì)COS-1細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。蛋白免疫印跡顯示,在過度表達(dá)miR-181 a-5p或miR-control的細(xì)胞中,MMP-14的異位表達(dá)水平并無顯著性差異,從而證實(shí)了MMP-143'UTR中miR-181應(yīng)答元件的存在。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-181a-5p對(duì)調(diào)節(jié)MMP-14表達(dá)水平的作用,我們合成了U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的miRNA海綿以下調(diào)miR-181a-5p的表達(dá)。相較于對(duì)照海綿,當(dāng)miR-181 a-5p海綿在表達(dá)高水平內(nèi)源性miR-181a-5p的MCF-7細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)時(shí),我們發(fā)現(xiàn)它能高效地降低細(xì)胞中的miR-181a-5p表達(dá)水平。為了闡明miRNA海綿介導(dǎo)的內(nèi)源性miR-181a-5p減少是否能夠?qū)е翸MP-14的表達(dá)水平升高,我們對(duì)內(nèi)源性表達(dá)和異位表達(dá)的MMP-14進(jìn)行了檢測(cè)。已有研究證實(shí),乏氧環(huán)境能夠誘導(dǎo)MMP-14表達(dá)上調(diào)。當(dāng)穩(wěn)定表達(dá)miRNA海綿的MCF-7細(xì)胞被置于乏氧環(huán)境下培養(yǎng)48小時(shí)后,相較于表達(dá)對(duì)照海綿的細(xì)胞,內(nèi)源性MMP-14在表達(dá)miR-181a-5 p海綿的細(xì)胞中被觀察到顯著上調(diào)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-181a-5p在調(diào)節(jié)MMP-14表達(dá)中的作用,我們檢測(cè)了miR-181a-5p對(duì)異位表達(dá)MMP-14的影響。我們使用MMP 14-GFP/3'-UTR對(duì)穩(wěn)定表達(dá)miRNA海綿的MCF-7細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,然后分析MMP14-GFP的信使RNA表達(dá)和蛋白表達(dá)。異位表達(dá)的miR-181a-5p海綿,而非miR-control海綿,導(dǎo)致了MMP14-GFP信使RNA水平和蛋白水平的顯著上調(diào),進(jìn)一步提示了MMP-14可被miR-181a-5p負(fù)性調(diào)節(jié)。4.miR-181 a-5p與MMP-143'-UTR的直接相互作用為了證實(shí)miR-181a-5p能夠直接靶定MMP-14 3'-UTR,我們將包含有預(yù)測(cè)的miR-181a-5p應(yīng)答元件的MMP-14 3'UTR序列融合到了熒光素酶報(bào)告基因中(Luc/3'-UTR).使用定點(diǎn)突變方法,我們又將預(yù)測(cè)的miR-181a-5p應(yīng)答元件(7個(gè)核苷酸)轉(zhuǎn)換成互補(bǔ)序列作為對(duì)照,以排除miR-181 a-5p的潛在結(jié)合(Luc/3'-UTRmu).miR-181a-5 p的表達(dá)顯著減少了Luc/3'-UTR的熒光素酶活性,而在表達(dá)miR-control或Luc/3'-UTRmu的細(xì)胞中則沒有觀察到這個(gè)現(xiàn)象。當(dāng)報(bào)告基因Luc/3'-UTR被轉(zhuǎn)染至穩(wěn)定表達(dá)miR-181a-5p海綿的MCF-7細(xì)胞時(shí),其熒光素酶活性相較于穩(wěn)定表達(dá)miR-control的細(xì)胞呈現(xiàn)顯著升高,而Luc/3'-UTRmu的熒光素酶活性則并沒有被miR-181a-5p所影響。因此,我們所觀察到的miR-181a-5p誘導(dǎo)的MMP-14表達(dá)下調(diào)直接依賴于MMP-14信使RNA 3'UTR上的一個(gè)單一同源識(shí)別位點(diǎn)。采用基于圖像的實(shí)驗(yàn)研究方法,我們觀察到共表達(dá)MMP 14-GFP/3'UTR和miR-181a-5p(無GFP)的COS-1細(xì)胞相較于共表達(dá)MMP 14-GFP/3'UTR和miR-control(無GFP)的對(duì)照細(xì)胞,其熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)顯者降低。相反地,相較于穩(wěn)定表達(dá)對(duì)照海綿的MCF-7細(xì)胞,MMP 14-GFP/3'-UTR的熒光強(qiáng)度在穩(wěn)定表達(dá)miR-181a-5p海綿的MCF-7細(xì)胞中呈現(xiàn)顯著升高。5.miR-181a-5p對(duì)功能性MMP-14的影響我們過去曾經(jīng)報(bào)道,功能性MMP-14能夠增強(qiáng)蛋白水解活性和細(xì)胞遷移能力。MMP-2是一種分泌性的基質(zhì)金屬蛋白酶,能夠促進(jìn)惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移,且一直被視為功能性MMP-14的指示器。因此我們隨后檢測(cè)了miR-181a-5p誘導(dǎo)的MMP-14表達(dá)量減少是否會(huì)導(dǎo)致MMP-2活性和細(xì)胞遷移能力的降低。相較于表達(dá)MMP-14/3'-UTR和miR-control或miR-128的對(duì)照細(xì)胞,將MMP-14/3'-UTR和miR-181a-5p/GFP共轉(zhuǎn)染至COS-1細(xì)胞后能夠?qū)е翸MP-2前體的激活減少,這種激活減少可通過MMP-2中間產(chǎn)物和完全激活狀態(tài)MMP-2的減少以及伴隨的MMP-2前體增多來證明,且與MMP-14的表達(dá)水平降低密切相關(guān)�？紤]到TIMP-2是MMP-14的天然抑制劑,因此我們檢測(cè)了miR-181a-5p誘導(dǎo)的MMP-14功能降低是否由于TIMP-2上調(diào)所致。然而我們的蛋白免疫印跡結(jié)果排除了這種可能性,因?yàn)閙iR-181a-5p并沒有增強(qiáng)TIMP-2在MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)。與MMP-2的活性降低相一致,miR-181 a-5p/GFP和MMP-14/3'-UTR在COS-1細(xì)胞中的異位表達(dá)導(dǎo)致了細(xì)胞遷移能力的顯著降低。重要的是,miR-128未能在表達(dá)MMP-14/3'-UTR的COS-1細(xì)胞中抑制細(xì)胞遷移能力,提示miR-181a-5p是調(diào)控MMP-14表達(dá)的一個(gè)關(guān)鍵因素,這種MMP-14的表達(dá)下調(diào)能夠?qū)е碌鞍姿鉂撃芎图?xì)胞遷移能力的顯著降低。6.人類惡性腫瘤細(xì)胞系和人類惡性腫瘤標(biāo)本中miR-181a-5p與MMP-14表達(dá)水平的負(fù)性相關(guān)已有研究證實(shí),MMP-14的表達(dá)上調(diào)可在侵襲性人類惡性腫瘤中被觀察到,且與人類惡性腫瘤細(xì)胞系的侵襲能力密切相關(guān)。為了探索內(nèi)源性miR-181a-5p水平與MMP-14表達(dá)在人類惡性腫瘤細(xì)胞系中的相關(guān)性,我們采用Real time PCR和蛋白免疫印記方法對(duì)人類惡性腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行了研究。如我們所料,MMP-14在高侵襲性惡性腫瘤細(xì)胞系中呈現(xiàn)相對(duì)較高的表達(dá)水平,例如HT1080細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞和乳腺癌干細(xì)胞SK-3rd。有趣的是,相較于低侵襲性惡性腫瘤細(xì)胞系,例如MCF-7細(xì)胞和SK-BR3細(xì)胞,miR-181a-5p在高侵襲性惡性腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)則呈現(xiàn)為顯著降低。為了闡明該現(xiàn)象的臨床意義,我們又檢測(cè)了miR-181a-5p和MMP-14表達(dá)水平在人類惡性腫瘤標(biāo)本中的相關(guān)性。由于MMP-14在正常結(jié)腸粘膜中的表達(dá)水平極低,但在位于浸潤(rùn)前緣的惡性腫瘤細(xì)胞中能夠呈現(xiàn)顯著升高的染色強(qiáng)度,因此我們采用大體手工刮取技術(shù),收集了人類結(jié)腸癌樣本中位于浸潤(rùn)前緣的腫瘤細(xì)胞和癌旁正常上皮細(xì)胞,然后行Real time PCR檢測(cè)miR-181a-5p的表達(dá)水平。與在細(xì)胞系中觀察到的結(jié)果一致,相較于癌旁正常上皮細(xì)胞,miR-181a-5p在侵襲性惡性腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)顯著表達(dá)降低。這些數(shù)據(jù)表明,MMP-14在侵襲性人類惡性腫瘤中的表達(dá)可被miR-181a-5p的表達(dá)水平所影響。為了進(jìn)一步闡明miR-181a-5p與MMP-14表達(dá)水平在惡性腫瘤進(jìn)展中的因果關(guān)系,我們使用MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行研究,因?yàn)橄噍^于其他惡性腫瘤細(xì)胞系,該細(xì)胞系具有高侵襲性且表達(dá)較高水平的MMP-14。當(dāng)MDA-MB-231細(xì)胞被瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-181a-5p/GFP后,其內(nèi)源性MMP-14表達(dá)在信使RNA水平和蛋白水平均呈顯著降低。這種相關(guān)性同樣也在高表達(dá)內(nèi)源性MMP-14的HT1080細(xì)胞中被重復(fù)了出來。MMP-14表達(dá)水平的特異性下調(diào)被證實(shí)能夠顯著抑制惡性腫瘤細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力,即使其他的基質(zhì)金屬蛋白酶仍在持續(xù)表達(dá)。因此,我們不禁要問miR-181a-5p是否能夠影響惡性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞遷移能力。通過Transwell/(?)室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)在MDA-MB-231細(xì)胞中過度表達(dá)miR-181a-5p能夠?qū)е略摷?xì)胞的遷移能力顯著降低。而miR-181a-5p所致的細(xì)胞遷移能力降低也在異位表達(dá)miR-181a-5p的HT1080細(xì)胞中被進(jìn)一步證實(shí)。由于細(xì)胞遷移是惡性腫瘤侵襲過程中至關(guān)重要的決定性步驟,因此我們采用了3D細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)以闡明MDA-MB-231細(xì)胞和HT1080細(xì)胞中過度表達(dá)的miR-181a-5p是否能夠抑制細(xì)胞的侵襲能力。如我們所料,當(dāng)miR-181a-5p過度表達(dá)時(shí),兩種細(xì)胞的細(xì)胞侵襲能力均呈現(xiàn)為顯著降低。由于MMP-14為跨膜蛋白酶,因此我們接下來要探討niR-181a-5p誘導(dǎo)的惡性腫瘤細(xì)胞遷移能力和侵襲能力的降低是否為細(xì)胞表面的MMP-14丟失所致。通過細(xì)胞表面生物素�；瘜�(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)在異位表達(dá)高水平2miR-181a-5p勺HT1080細(xì)胞中,細(xì)胞表面的MMP-14相較于對(duì)照細(xì)胞呈現(xiàn)顯著降低。7.過度表達(dá)miR-181a-5p能夠降低惡性腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)侵襲能力和血管生成能力MMP-14的表達(dá)與惡性腫瘤侵襲能力的增強(qiáng)常�；橄嚓P(guān)。為了直接檢測(cè)miR-181a-5p是否能夠抑制MMP-14介導(dǎo)的惡性腫瘤細(xì)胞穿透基底膜的體內(nèi)侵襲能力,我們進(jìn)行了雞胚絨毛尿囊膜(Chick chorioallantoic membrane, CAM)侵襲實(shí)驗(yàn)。雞胚絨毛尿囊膜包含了絨毛膜上皮和下層的主要由IV型膠原構(gòu)成的尿囊膜,該尿囊膜能夠模擬人類上皮細(xì)胞的基底膜。惡性腫瘤細(xì)胞穿透表層的雞胚絨毛尿囊膜的上皮細(xì)胞和基底膜進(jìn)入結(jié)締組織的侵襲現(xiàn)象,可經(jīng)蘇木素-伊紅染色后被觀察到。被加至雞胚絨毛尿囊膜上的表達(dá)niR-control的MDA-MB-231細(xì)胞能夠穿透已破壞的基底膜,侵襲進(jìn)入到結(jié)締組織當(dāng)中。相反的是,穩(wěn)定表達(dá)miR-181 a-5p 的 MDA-MB-231細(xì)胞則未能穿透該基底膜。另外,相較于表達(dá)miR-181a-5p的細(xì)胞,載有表達(dá)miR-control細(xì)胞的雞胚絨毛尿囊膜下能夠觀察到顯著增多的新生血管。這種體內(nèi)侵襲能力和血管生成能力的降低,提示miR-181a-5p能夠有效地干擾高水平表達(dá)MMP-14的MDA-MB-231細(xì)胞的體內(nèi)侵襲能力。為了進(jìn)一步闡明miR-181a-5p通過下調(diào)MMP-14表達(dá)所發(fā)揮的抗血管生成功能,我們使用了HT1080細(xì)胞進(jìn)行研究。由于HT1080細(xì)胞僅表達(dá)極少量的miR-181a-5p,因此我們?cè)谠摷?xì)胞中穩(wěn)定過表達(dá)了miR-181a-5p,然后像我們過去報(bào)道的那樣,將吸附有細(xì)胞的明膠海綿置于絨毛尿囊膜表面。miR-181a-5p,而非miR-control,能夠顯著抑制HT1080細(xì)胞誘導(dǎo)的新生血管形成。綜上所述,我們的研究首次闡明了miR-181a-5p是MMP-14表達(dá)水平的重要調(diào)節(jié)者,而且能夠影響MMP-14介導(dǎo)的惡性腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲和血管生成能力。結(jié)論本研究中,我們發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p在高侵襲性人類乳腺癌以及人類結(jié)腸癌中表達(dá)水平下調(diào),且與這些腫瘤的MMP-14表達(dá)水平呈負(fù)性相關(guān)。在臨床樣本中,相較于癌旁正常組織,我們發(fā)現(xiàn)MMP-14的表達(dá)水平在位于浸潤(rùn)前緣區(qū)域內(nèi)的腫瘤組織中顯著升高,而這些組織內(nèi)的miR-181a-5p表達(dá)水平則顯著降低。通過生物信息學(xué)分析,我們?cè)贛MP-14的3'-非翻譯區(qū)內(nèi)找到了潛在的miR-181a-5p應(yīng)答元件,且在后續(xù)的報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)中被我們所證實(shí)。過量表達(dá)的miR-181a-5p可顯著降低MMP-14的表達(dá)水平,反之,干擾表達(dá)miR-181a-5p可造成MMP-14的表達(dá)水平顯著升高。在進(jìn)一步研究這兩個(gè)基因間的相互關(guān)系時(shí),我們發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p介導(dǎo)的MMP-14表達(dá)下調(diào),可使惡性腫瘤細(xì)胞的遷移能力、侵襲能力顯著降低,同時(shí)可減少潛活狀態(tài)基質(zhì)金屬蛋白酶-2(pro-MMP-2)的激活。此外,在雞胚絨毛尿囊膜試驗(yàn)中,miR-181a-5p介導(dǎo)的MMP-14表達(dá)下調(diào)被證實(shí)可顯著降低惡性腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)侵襲能力以及血管生成能力。綜上所述,我們的研究成果闡明了miR-181a-5p在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)惡性腫瘤中MMP-14表達(dá)的調(diào)控機(jī)制,揭示了通過增強(qiáng)表達(dá)miR-181a-5p從而實(shí)現(xiàn)預(yù)防惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的新策略。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R730.2
，

本文編號(hào)：2471834