【摘要】：背景結(jié)直腸癌(Colorectal Cancer,CRC)作為威脅人類健康的惡性腫瘤之一,具有極高的發(fā)病率和致死率。腫瘤抑制基因P53的突變或失活是引起結(jié)直腸癌的重要誘因。P53凋亡刺激蛋白2(apoptosis stimulating protein 2 of p53,ASPP2)能夠與P53結(jié)合,選擇性增強(qiáng)P53的促細(xì)胞凋亡活性。HIV蛋白酶抑制劑(Protease Inhibitors,PIs)是用于治療HIV感染的化療藥物,其藥理機(jī)制是抑制天冬酰胺蛋白酶前體的裂解活化,進(jìn)而抑制HIV病毒顆粒的成熟。近期研究發(fā)現(xiàn)HIV PIs有著廣泛的抗腫瘤作用。體外方面,已有多篇文章報(bào)道HIV PIs對(duì)乳腺癌、非小細(xì)胞型肺癌、肝細(xì)胞癌和卡波西肉瘤等有抗腫瘤作用。體內(nèi)方面,有人用裸鼠試驗(yàn)證明HIV PIs能夠有效地抑制肺癌、乳腺癌和肝癌腫瘤生長。而有關(guān)HIV PIs對(duì)結(jié)直腸癌的影響鮮有報(bào)道。目的本實(shí)驗(yàn)擬在以往研究的基礎(chǔ)上,結(jié)直腸癌細(xì)胞在不同P53表達(dá)水平時(shí),研究HIV PIs對(duì)其自噬、凋亡的影響,結(jié)直腸癌細(xì)胞在相同P53表達(dá)水平時(shí),研究HIV PIs與奧沙利鉑相比,兩者對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡和自噬水平的影響,以及在ASPP2不同表達(dá)水平時(shí),HIV蛋白酶抑制劑對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞自噬及凋亡的影響。為進(jìn)一步深入研究HIV PIs單獨(dú)或聯(lián)合奧沙利鉑等結(jié)直腸癌化療對(duì)結(jié)直腸癌治療提供可靠依據(jù)。方法第一部分實(shí)驗(yàn):1.慢病毒轉(zhuǎn)染除HCT116+/+(P53野生型)中P53基因得到穩(wěn)轉(zhuǎn)表達(dá)的P53卻失型細(xì)胞(HCT116+/+-sh P53)及ASPP2卻失型細(xì)胞(HCT116+/+-sh ASPP2)以及對(duì)照細(xì)胞(HCT116+/+-sh Ctrl);2.MTT法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)(12小時(shí)、24小時(shí)及36小時(shí))三種HIV蛋白酶抑制劑(利托那韋、洛匹那韋、地瑞那韋)分別對(duì)HCT116+/+-sh Ctr(p53野生型)細(xì)胞生長抑制的影響;以及藥物作用24小時(shí)后分別對(duì)HCT16+/+-sh Ctrl/HCT116+/+-sh P53細(xì)胞生長抑制的影響第二部分實(shí)驗(yàn):1.分別用地瑞那韋和奧沙利鉑對(duì)HCT116+/+-sh Ctrl細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度處理HCT116+/+-sh Ctrl細(xì)胞,24小時(shí)后,利用Western-blot分析自噬蛋白LC3及凋亡蛋白Casepase-3水平變化及Calcein-AM/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況;2.為檢測(cè)不同ASPP2表達(dá)水平上,HIV蛋白酶抑制劑地瑞那韋對(duì)大腸癌細(xì)胞自噬凋亡的影響,本實(shí)驗(yàn)分組為GFP組、ASPP2組、sh ASPP2組、GFP+DRV組、ASPP2+DRV組、sh ASPP2+DRV組共6組;3.為檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞周期的影響及不同ASPP2表達(dá)水平時(shí)地瑞那韋對(duì)細(xì)胞周期的影響,本實(shí)驗(yàn)分組為對(duì)照組、GFP組、ASPP2組、ASPP2+DRV組、GFP+DRV組、DRV組。結(jié)果第一部分:1.經(jīng)慢病毒敲除P53及ASPP2基因,得到能夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系,結(jié)果由WB驗(yàn)證;2..蛋白酶抑制劑地瑞那韋可以誘導(dǎo)HCT116+/+-sh Ctrl細(xì)胞凋亡,而且凋亡比例隨著藥物濃度的升高而增強(qiáng);3.本次實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測(cè)12h/24h/36h三個(gè)不同時(shí)間點(diǎn),三種蛋白酶抑制劑RTV、LPV、DRV對(duì)HCT116+/+細(xì)胞生長抑制的影響;在三個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)中,藥物作用24h時(shí)所獲得的曲線相對(duì)更為穩(wěn),因此選取24h為最佳作用時(shí)間。選取藥物作用24h,檢測(cè)三種蛋白酶抑制劑分別對(duì)HCT116+/+-sh Ctrl及HCT116+/+sh P53細(xì)胞生長抑制的影響。得出三種蛋白酶抑制劑誘導(dǎo)HCT116+/+sh Ctr細(xì)胞半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為利托那韋IC50約為25μg/ml、洛匹那韋IC50約為25μg/ml、地瑞那韋約為40μg/ml;誘導(dǎo)HCT116+/+sh P53細(xì)胞半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為利托那韋約為20μg/ml、洛匹那韋約為18μg/ml、地瑞那韋約為30μg/ml。我們發(fā)現(xiàn)與HCT116+/+-sh Ctr相比,HCT116+/+-sh P53對(duì)HIV PIs化療更敏感。第二部分:1.與奧沙利鉑相比,蛋白酶抑制劑地瑞那韋也能誘導(dǎo)細(xì)胞自噬凋亡;2.利用Calcein-AM/PI染色法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況,各組細(xì)胞凋亡率分別為(1.85±0.53)%、(4.57±0.75)%、(1.95±0.44)%、(39.5±4.29)%、(47.7±6.20)%、(32.68±2.49)%,GFP組與ASPP2組相比(P0.01)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,GFP+DRV組與ASPP2+DRV組相比(P=0.0360.05)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;ASPP2+DRV組與sh ASPP2+DRV組相比(P0.01)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;利用WB檢測(cè)細(xì)胞自噬、凋亡蛋白表達(dá)水平。我們發(fā)現(xiàn)ASPP2過表達(dá)可增強(qiáng)HCT116-P53+/+細(xì)胞對(duì)地瑞那韋的敏感性;ASPP2低表達(dá)可以促進(jìn)HCT116-P53+/+細(xì)胞自噬,降低其對(duì)地瑞那韋的敏感性;3.檢測(cè)細(xì)胞周期我們發(fā)現(xiàn)各組細(xì)胞的增殖指數(shù)分別為(48.72±2.06)%、(45.00±5.64)%、(40.25±3.96)%、(18.55±1.38)%、(26.70±1.07)%、(28.56±2.53)%,在組間兩兩比較中,除正常培養(yǎng)組與GFP組(P=0.2890.05)以及地瑞那韋組與奧沙利鉑組(P=0.482,0.05)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義之外,其余組間兩兩比較P0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論1.與HCT116+/+-sh Ctrl相比,HCT116+/+-sh P53對(duì)HIV PIs化療效果更敏感。2.HIV蛋白酶抑制劑具有誘導(dǎo)細(xì)胞自噬凋亡能力,但與奧沙利鉑對(duì)照組相比,其誘導(dǎo)細(xì)胞自噬凋亡能力與奧沙利鉑相當(dāng)。3.ASPP2過表達(dá)可以抑制HCT116細(xì)胞自噬,提高其對(duì)HIV蛋白酶抑制劑地瑞那韋的敏感性;相反,抑制ASPP2表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞自噬,降低其對(duì)地瑞那韋的敏感性。4.地瑞那韋能通過引起G0/G1期阻滯抑制腫瘤細(xì)胞增殖,同時(shí),ASPP2能協(xié)同增強(qiáng)其抑制腫瘤細(xì)胞增殖效果。
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【學(xué)位授予單位】：濟(jì)南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.34

【參考文獻(xiàn)】

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1 王賁士;喬錄新;石英;封曉昆;陳德喜;郭洪亮;;p53凋亡刺激蛋白2抑制奧沙利鉑誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞自噬并促進(jìn)凋亡[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2015年07期

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本文編號(hào)：2471119