【摘要】：研究背景和目的:骨肉瘤(Osteosarcoma)是最常見骨腫瘤之一,常發(fā)生于兒童和青少年。它以侵襲性生長(zhǎng)、高局部復(fù)發(fā)率及遠(yuǎn)期生存率不佳而聞名。約有50%的病例會(huì)發(fā)生早期轉(zhuǎn)移,尤其是肺轉(zhuǎn)移。該疾病的治療方法主要為手術(shù)切除及手術(shù)前后放化療等,但據(jù)最新的文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)報(bào)道,傳統(tǒng)的治療效果均不佳。近年來,國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者提出靶基因治療,并期待該治療方案成為治療該疾病的新策略。S100A9最早被發(fā)現(xiàn)是一種中性粒細(xì)胞表達(dá)和分泌的免疫蛋白,后來的研究表明S100A9是急性和慢性炎癥中最重要的炎癥介質(zhì)之一。近期發(fā)現(xiàn)S100A9在腫瘤發(fā)生和腫瘤微環(huán)境中也有重要的作用。此次實(shí)驗(yàn)的研究目的是探尋S100A9在骨肉瘤中的表達(dá)以及S100A9對(duì)骨肉瘤增殖、遷徙、侵襲等功能的影響及相關(guān)機(jī)制。方法:1.收集骨肉瘤病例及相關(guān)病人資料;2.應(yīng)用組織芯片技術(shù)、熒光定量PCR和western blot分析S100A9在骨肉瘤病理組織標(biāo)本中的表達(dá)情況;3.采用RNAi技術(shù)下調(diào)三種骨肉瘤細(xì)胞(U2OS、143B、MG63)中s100a9的表達(dá);4.應(yīng)用熒光定量pcr和westernblott法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染后s100a9的mrna和蛋白表達(dá)情況;5.應(yīng)用cck8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后三種骨肉瘤細(xì)胞在體外增殖能力的變化;6.應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后三種骨肉瘤細(xì)胞細(xì)胞周期的變化;7.應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后三種骨肉瘤細(xì)胞細(xì)胞凋亡的變化8.transwell遷徙實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后三種骨肉瘤細(xì)胞遷徙能力的變化;9.transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后三種骨肉瘤細(xì)胞侵襲能力的變化;10.裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后骨肉瘤在體內(nèi)增殖能力的改變;11.通過免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)荷瘤pcna和ki67增殖指數(shù)進(jìn)行分析,進(jìn)一步證實(shí)下調(diào)s100a9對(duì)骨肉瘤增殖的影響;12.westernblot和酶活性檢測(cè)法探尋在三種骨肉瘤細(xì)胞中下調(diào)s100a9對(duì)mapk和nf-κb兩條信號(hào)通路的影響;13.westernblott法和酶活性檢測(cè)法探尋在三種骨肉瘤細(xì)胞中下調(diào)s100a9后對(duì)細(xì)胞周期依賴激酶抑制劑p21和p27的影響;14.酶活性檢測(cè)法探尋在三種骨肉瘤細(xì)胞中,下調(diào)s100a9后對(duì)細(xì)胞周期依賴激酶cdk2和cdk4的影響。結(jié)果:1.本研究一共納入了120例骨肉瘤病理標(biāo)本和40例正常的骨組織標(biāo)本,根據(jù)enneking分期將所有的骨肉瘤病例資料分為了i期、ii期和iii期;2.組織芯片技術(shù)表明s100a9在骨肉瘤病理組織中呈高表達(dá),95%的病例為陽(yáng)性;s100a9的染色區(qū)域分布在細(xì)胞核(21/120,17.5%)、細(xì)胞胞漿(24/120,20%),兩者均表達(dá)(69/120,57.5%),但是在這三部分的染色指數(shù)分析沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。同時(shí),對(duì)性別、年齡和發(fā)病部位的染色指數(shù)分析也沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的(p0.05)。并且發(fā)現(xiàn),高級(jí)別骨肉瘤病例的染色指數(shù)是明顯高于低級(jí)別骨肉瘤病例,gradei的染色指數(shù)為2.2±1.4,gradeii的染色指數(shù)為3.3±1.3,gradeiii的染色指數(shù)為4.2±0.9,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05,除了i期和ii期之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。我們也對(duì)所收集的病理標(biāo)本進(jìn)行了熒光定量pcr的檢測(cè),其結(jié)果與免疫組織化學(xué)結(jié)果相吻合;3.應(yīng)用熒光定量pcr和westernblot技術(shù)驗(yàn)證了下調(diào)s100a9后mrna水平和s100a9的蛋白表達(dá)水平明顯降低,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),這證明我們建立細(xì)胞模型是成功的;4.cck8法表明,在體外實(shí)驗(yàn)中,下調(diào)s100a9后能夠明顯抑制三種骨肉瘤細(xì)胞的增殖,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);5.流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)細(xì)胞周期的檢測(cè)表明下調(diào)s100a9能夠使骨肉瘤細(xì)胞停留在細(xì)胞周期的g0/g1期,減緩進(jìn)入s期的數(shù)量,從而抑制了骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)周期,進(jìn)而抑制了細(xì)胞生長(zhǎng)(p0.05);6.流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)細(xì)胞周期的檢測(cè)表明s100a9對(duì)骨肉瘤的凋亡沒有影響(p0.05);7.transwell遷徙實(shí)驗(yàn)表明下調(diào)s100a9后能降低三種骨肉瘤細(xì)胞的遷徙能力:u20s組從每視野84±5個(gè)細(xì)胞下降到42±6個(gè)細(xì)胞;143b組每視野81±4個(gè)細(xì)胞下降到44±5個(gè)細(xì)胞;mg63從78±4個(gè)細(xì)胞下降到55±4個(gè)細(xì)胞(p0.05);8.transwell侵襲實(shí)驗(yàn)表明下調(diào)s100a9能降低三種骨肉瘤細(xì)胞的侵襲能力:u20s組從每視野58±7個(gè)細(xì)胞下降到38±4個(gè)細(xì)胞;143b組每視野62±4個(gè)細(xì)胞下降到43±5個(gè)細(xì)胞;mg63從67±4個(gè)細(xì)胞下降到49±5個(gè)細(xì)胞(p0.05);9.裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)證明了在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,下調(diào)s100a9能夠影響骨肉瘤的生長(zhǎng)(p0.05);10.免疫組織化學(xué)表明下調(diào)s100a9明顯降低了荷瘤pcna和ki67的增殖指數(shù)。pcna免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示:u2os從60±5%下降到39±4%;143b從66±7%下降到43±6%;mg63從63±6%下降到42±4%(p0.05)。ki67免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示:u2os從58±7%下降到41±4%;143b從69±9%下降到47±6%;mg63從68±5%下降到42±7%(p0.05);11.westernblot和酶活性檢測(cè)表明下調(diào)s100a9能夠抑制骨肉瘤細(xì)胞中磷酸化的erk1/2mapk、p50nf-κb、p65nf-κb的表達(dá),而不能抑制磷酸化p38mapk的表達(dá);12.westernblot表明下調(diào)s1000a9能夠激活骨肉瘤細(xì)胞中細(xì)胞周期依賴激酶抑制劑p21和p27的表達(dá);13.酶活性檢測(cè)表明下調(diào)s100a9能抑制骨肉瘤細(xì)胞中細(xì)胞周期依賴激酶CDK2和CDK4的表達(dá),進(jìn)而影響細(xì)胞生長(zhǎng)。結(jié)論:此次研究通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了下調(diào)S100A9的表達(dá)能夠影響骨肉瘤的增殖、遷徙和侵襲能力,并能通過抑制MAPK和NF-κB兩條通路的表達(dá),進(jìn)而激活p21和p27,抑制CDK2和CDK4的表達(dá)。這為骨肉瘤的靶基因治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R738.1

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本文編號(hào)：2468803