【摘要】：背景和目的:肺癌(Lung Cancer,LC)在所有惡性腫瘤相關(guān)死亡原因中位居首位。小細(xì)胞肺癌(SCLC)是肺癌中預(yù)后最差的類型,在LC中占14-20%的比例。其生長(zhǎng)速度快,轉(zhuǎn)移早,預(yù)后差。即使經(jīng)歷正規(guī)放化療,SCLC患者中位生存期僅為8-13個(gè)月。順鉑耐藥導(dǎo)致的治療效果不佳是SCLC患者生存率不高的重要原因。因此,積極探討SCLC耐藥的具體機(jī)制對(duì)改善SCLC預(yù)后具有重要的指導(dǎo)意義。順鉑(CDDP),為一種最常用的細(xì)胞毒類化療藥物。絕大部分小細(xì)胞肺癌患者均采用以順鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合治療方案。然而,暴露于順鉑的惡性細(xì)胞可能激活自身適應(yīng)性反應(yīng)來(lái)抵抗順鉑的抗增殖/細(xì)胞毒作用,并最終產(chǎn)生對(duì)順鉑的耐藥性,使患者對(duì)以順鉑為基礎(chǔ)的化療反應(yīng)不佳。PI3K/AKT通路是生理功能必需的信號(hào)傳導(dǎo)通路,其信號(hào)軸可提供強(qiáng)大的促生存因子。因此,AKT通路可能在腫瘤順鉑靶下耐藥中扮演了重要的角色。但其詳細(xì)作用的機(jī)制及其在順鉑耐藥中的重要程度尚不很清楚。SHP2(Src homology 2-containing protein tyrosine phosphatase 2),是一種在人體多種組織中廣泛表達(dá)的非受體蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)。它在多種細(xì)胞事件過(guò)程如細(xì)胞增殖、存活、遷移中起著關(guān)鍵作用。對(duì)SHP2突變或異常表達(dá)與血液惡性腫瘤及多個(gè)實(shí)體瘤有關(guān)。SHP2可以以連接蛋白的功能結(jié)合PI3K的P85亞基及相關(guān)激活促進(jìn)因子,導(dǎo)致PI3K活化。SHP2也能通過(guò)PTP催化活性依賴的方式,激活PI3K/Akt信號(hào)。但SHP2激活PI3K/Akt的效應(yīng)研究主要集中在腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移方面,它在腫瘤耐藥中的作用還未得到充分認(rèn)識(shí)。我們前期發(fā)現(xiàn)SHP2在化療耐藥的肺癌細(xì)胞中高表達(dá),提示它可能參與了肺癌化療耐藥過(guò)程。CA916798是我們前期通過(guò)消減抑制雜交(SSH)在肺癌多藥耐藥細(xì)胞株SPC-A-1/CDDP中發(fā)現(xiàn)的耐藥相關(guān)蛋白。其與目前已知蛋白無(wú)同源性。CA916798的結(jié)構(gòu)中有多個(gè)絲/蘇氨酸激酶及酪氨酸激酶激活位點(diǎn),表明它可被相關(guān)激酶激活,參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。研究表明,CA916798對(duì)肺腫瘤細(xì)胞順鉑敏感性下降起促進(jìn)作用,且可被PI3K/AKT通路調(diào)節(jié)�；谝陨涎芯课覀兺茰y(cè):SHP2可通過(guò)PI3K/AKT通路調(diào)節(jié)CA916798的表達(dá),進(jìn)而導(dǎo)致SCLC對(duì)順鉑耐藥。本研究即為證實(shí)以上推測(cè)而進(jìn)行。材料與方法:本研究分為體外實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)試驗(yàn)和臨床檢測(cè)分析三大部分。1.以順鉑敏感的親代小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446及在采用順鉑誘導(dǎo)親代細(xì)胞建立的耐藥細(xì)胞株H446/CDDP為研究對(duì)象2.將SHP2表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染親代細(xì)胞H446,SHP2 Sh RNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染耐藥細(xì)胞H446/CDDP,并篩選出穩(wěn)定高/低表達(dá)SHP2的細(xì)胞株3.在干預(yù)SHP2的同時(shí),轉(zhuǎn)染AKT持續(xù)表達(dá)質(zhì)粒或AKT RNA干擾質(zhì)粒,觀察在不同AKT表達(dá)水平的情況下,SHP2誘導(dǎo)的SCLC順鉑耐藥程度是否有所改變4.采用CCK8法檢測(cè)各細(xì)胞株對(duì)順鉑敏感程度5.免疫共沉淀檢測(cè)與SHP2相互結(jié)合的蛋白6.Western-blotting檢測(cè)各蛋白表達(dá)水平7.Real-time PCR測(cè)定相關(guān)蛋白m RNA表達(dá)量8.將上述各細(xì)胞株皮下注射入裸鼠體內(nèi),建立裸鼠移植瘤模型9.順鉑或生理鹽水腹腔注射對(duì)裸鼠移植瘤進(jìn)行處理,通過(guò)觀察各組裸鼠移植瘤體積的變化,判斷各組細(xì)胞對(duì)順鉑治療的敏感程度10.篩選經(jīng)化療4-6周期的小細(xì)胞肺癌病人,收集數(shù)據(jù),并取腫瘤組織進(jìn)行HE及免疫組化染色,檢測(cè)SHP2及CA916798蛋白表達(dá)的相關(guān)性,同時(shí)比較不同蛋白表達(dá)水平的患者在化療后生存時(shí)間有無(wú)差異。結(jié)果:1.SHP2在SCLC順鉑耐藥中的作用(1)對(duì)實(shí)驗(yàn)所用順鉑敏感的H446細(xì)胞及對(duì)順鉑耐藥的H446/CDDP細(xì)胞進(jìn)行鑒定,神經(jīng)特異性烯醇化酶(NSE)免疫熒光顯示H446及H446/CDDP均有NSE表達(dá),證實(shí)所用細(xì)胞確為小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系。(2)H446細(xì)胞順鉑IC50值為2.493ug/ml,H446/CDDP細(xì)胞順鉑IC50值為15.239ug/ml。H446/CDDP的耐藥指數(shù)為6.1127(vs.H446)。與未經(jīng)干預(yù)的H446細(xì)胞比較,H446/CDDP能耐受更高濃度的順鉑。(3)Western-blotting結(jié)果顯示,與H446細(xì)胞比較,H446/CDDP中SHP2表達(dá)量明顯上升(P0.05)。(4)將SHP2表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H446細(xì)胞并進(jìn)行篩選,建立持續(xù)表達(dá)高水平量SHP2的H446-SHP2細(xì)胞株;將SHP2 Sh RNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染順鉑耐藥細(xì)胞H446/CDDP并進(jìn)行篩選,建立持續(xù)表達(dá)低水平量SHP2的H446/CDDP-sh SHP2細(xì)胞株。H446-SHP2與H446比較,SHP2表達(dá)量升高;H446/CDDP-sh SHP2與H446/CDDP比較,SHP2表達(dá)量降低,提示對(duì)SHP2的表達(dá)干預(yù)成功。(5)半定量測(cè)定結(jié)果表明各細(xì)胞株SHP2 m RNA表達(dá)水平與蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)趨勢(shì),但這種相關(guān)趨勢(shì)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(6)總磷酸酶活性檢測(cè)顯示:各細(xì)胞株總磷酸酶活性亦有與蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)趨勢(shì),但差異仍未有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(7)H446順鉑IC50值為5.14ug/ml,H446-SHP2順鉑IC50值為10.414 ug/ml。H446-SHP2耐藥指數(shù)為2.03(vs.H446)。H446/CDDP順鉑IC50值為13.351 ug/ml,H446/CDDP-sh SHP2順鉑IC50值為6.621ug/ml,H446/CDDP-sh SHP2的耐藥指數(shù)為0.4959(vs.H446/CDDP)。在對(duì)順鉑敏感的H446細(xì)胞株中,高表達(dá)SHP2可使H446細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥;在對(duì)順鉑耐受的H446/CDDP細(xì)胞株中,部分抑制SHP2表達(dá)可使順鉑耐藥的細(xì)胞株H446/CDDP部分恢復(fù)對(duì)順鉑的敏感性。2.SHP2促進(jìn)SCLC順鉑耐藥的機(jī)制(1)在H446及H446/CDDP細(xì)胞內(nèi),SHP2與PI3K p85亞基及CA916798均可結(jié)合。在總SHP2量大致相同的情況下,H446/CDDP細(xì)胞與H446細(xì)胞比較,SHP2結(jié)合的p85及CA916798的量更多。加入順鉑后與加入順鉑前比較,SHP2結(jié)合的p85及CA916798的量也有所增加。(2)H446細(xì)胞高表達(dá)SHP2后,AKT、p AKT、pm TOR及CA916798蛋白表達(dá)隨之增高(P0.05)。在順鉑耐藥的H446/CDDP細(xì)胞,部分抑制SHP2蛋白表達(dá)后,下游AKT、p AKT、pm TOR、CA916798蛋白表達(dá)隨之降低(P0.05)。這提示SHP2表達(dá)量的變化可影響下游AKT通路相關(guān)蛋白的活性及CA916798表達(dá)量的變化。(3)與轉(zhuǎn)入空載體比較,H446細(xì)胞在轉(zhuǎn)染AKT RNA干擾質(zhì)粒后,AKT蛋白表達(dá)水平下降;轉(zhuǎn)染AKT表達(dá)質(zhì)粒后,AKT蛋白表達(dá)水平升高。說(shuō)明相關(guān)質(zhì)�？捎行Ц深A(yù)AKT的表達(dá)。(4)在高表達(dá)SHP2的H446細(xì)胞中部分抑制AKT表達(dá),可使增高的CA916798表達(dá)量降低(P0.05)。在低表達(dá)SHP2的H446細(xì)胞中高表達(dá)AKT可使降低的CA916798恢復(fù)到一個(gè)比較高的水平(P0.05)。說(shuō)明SHP2可通過(guò)AKT調(diào)控CA916798表達(dá)量變化。(5)H446細(xì)胞順鉑IC50值為4.82ug/ml,H446-SHP2順鉑IC50值為10.902ug/ml,H446-SHP2-si AKT順鉑IC50值為6.236ug/ml。上述結(jié)果表明:在持續(xù)表達(dá)高水平SHP2的H446-SHP2細(xì)胞中部分抑制AKT,可使耐藥性增高的H446-SHP2細(xì)胞部分恢復(fù)對(duì)順鉑的敏感性。H446/CDDP順鉑IC50值為11.032ug/ml,H446/CDDP-sh SHP2順鉑IC50值為5.983ug/ml,H446/CDDP-sh SHP2-AKT順鉑IC50值為9.344ug/ml。上述結(jié)果表明:在部分抑制SHP2的H446/CDDP細(xì)胞中高表達(dá)AKT,可使本來(lái)對(duì)順鉑耐藥性下降的H446/CDDP-sh SHP2細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性又恢復(fù)到比較高的水平。對(duì)AKT表達(dá)水平進(jìn)行干預(yù),可部分抵消SHP2表達(dá)變化對(duì)SCLC細(xì)胞順鉑耐藥性的影響。3.SHP2在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)SCLC順鉑耐藥性的影響與生理鹽水處理比較,H446組與H446/CDDP-sh SHP2組順鉑治療后腫瘤體積均明顯縮小(P0.05),H446-SHP2組與H446/CDDP組順鉑治療后腫瘤體積差異均不顯著(P0.05)。這從動(dòng)物體內(nèi)水平證實(shí)高表達(dá)SHP2可導(dǎo)致小細(xì)胞肺癌對(duì)順鉑敏感性下降,部分抑制SHP2可使小細(xì)胞肺癌對(duì)順鉑敏感性增加。4.臨床驗(yàn)證SHP2和CA916798表達(dá)相關(guān)性及與化療耐藥的關(guān)系(1)共有20名腫瘤組織高表達(dá)SHP2的患者及12名腫瘤組織低表達(dá)SHP2的患者入組分析,兩組在性別、年齡、初始化療周期等方面的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。20名高表達(dá)SHP2的小細(xì)胞肺癌患者的腫瘤組織中有13名同時(shí)高表達(dá)CA916798,而12名低表達(dá)SHP2的小細(xì)胞肺癌患者中僅有3名同時(shí)高表達(dá)CA916798(P0.05)。表明人小細(xì)胞肺癌腫瘤組織SHP2與CA916798表達(dá)具有一定的相關(guān)性。(2)生存曲線分析顯示,與小細(xì)胞肺癌腫瘤組織低表達(dá)SHP2患者比較,高表達(dá)SHP2的患者平均生存時(shí)間更短(P=0.045)。與腫瘤組織低表達(dá)CA916798患者比較,高表達(dá)CA916798的患者平均生存時(shí)間更短(P=0.002)。說(shuō)明高表達(dá)SHP2及CA916798與患者對(duì)化療預(yù)后不佳有關(guān)。結(jié)論:本研究提供的證據(jù)顯示,SHP2可促進(jìn)SCLC對(duì)順鉑耐受性增加,其機(jī)制主要是通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT/CA916798這一信號(hào)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在臨床小細(xì)胞肺癌患者中,腫瘤組織SHP2及CA916798表達(dá)情況可作為化療預(yù)后相關(guān)指標(biāo)。我們的研究初步闡明SHP2/PI3K/AKT/CA916798這一通路在SCLC化療耐藥中的作用及機(jī)制,為今后臨床逆轉(zhuǎn)SCLC順鉑耐藥奠定了一定的理論基礎(chǔ),并提供了可供干預(yù)的靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R734.2

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 程玉生;徐峰;沈華浩;;蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2與呼吸系統(tǒng)疾病[J];生理科學(xué)進(jìn)展;2011年05期

2 谷佳;韓濤;趙寧;謝曉冬;郭星;;蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2與腫瘤[J];中國(guó)腫瘤生物治療雜志;2013年05期

相關(guān)會(huì)議論文 前2條

1 胡佳;李聰;楊朝勇;;蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2核酸適體的篩選及其在腫瘤研究中的應(yīng)用[A];中國(guó)化學(xué)會(huì)第27屆學(xué)術(shù)年會(huì)第03分會(huì)場(chǎng)摘要集[C];2010年

2 唐春蘭;;SHP2在順鉑誘導(dǎo)的肺癌多藥耐藥細(xì)胞中的表達(dá)及意義[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)年會(huì)——2011（第十二次全國(guó)呼吸病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議）論文匯編[C];2011年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前5條

1 楊雪梅;SHP2在小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥中的作用及機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

2 唐春蘭;SHP2在順鉑誘導(dǎo)的肺癌多藥耐藥中的作用及其分子機(jī)制的初步研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2013年

3 李碩敏;蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2調(diào)控肺上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的生化機(jī)制[D];浙江大學(xué);2014年

4 孫軒;SHP2調(diào)控EGFR/ERK信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌增殖轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2017年

5 于冰;SHP2磷酸酶小分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)和抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用及機(jī)制的研究[D];沈陽(yáng)藥科大學(xué);2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前4條

1 陳佳;SHP2抑制劑PHPS1對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的保護(hù)作用及機(jī)制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2015年

2 駱歡;基于芳環(huán)串聯(lián)的SHP2抑制劑的設(shè)計(jì)、合成及活性評(píng)價(jià)[D];江南大學(xué);2016年

3 李芬芬;蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2在香煙誘導(dǎo)的肺癌炎癥反應(yīng)中的調(diào)節(jié)作用[D];浙江大學(xué);2012年

4 趙麗芳;蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2調(diào)控肺部炎癥和細(xì)菌清除的機(jī)制研究[D];浙江大學(xué);2015年

，

本文編號(hào)：2466744