【摘要】：目的:食管癌是發(fā)生在食管粘膜上皮的惡性腫瘤,是世界第七大惡性腫瘤。我國(guó)是世界上食管癌發(fā)生率和重中之重重中之重病死率最高的國(guó)家之一,嚴(yán)重困擾著國(guó)民的身心健康,所以,尋找食管癌的特異性生物標(biāo)記物,用于早期診斷和靶向治療成為研究食管癌的熱點(diǎn)。腫瘤免疫療法是繼手術(shù)、放化療后第四大有效的抗腫瘤療法,免疫療法基于腫瘤特異性抗原和免疫細(xì)胞。近年來,共刺激分子B7-H3作為B7免疫球蛋白超家族的新成員,在多種腫瘤組織異常高表達(dá),并與腫瘤的生物學(xué)特性密切相關(guān),被認(rèn)為可能是一種新的腫瘤標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。腫瘤微環(huán)境中大量存在的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages,TAM)在腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中扮演著十分重要的角色。腫瘤特定微環(huán)境迫使巨噬細(xì)胞表型向著有利于腫瘤發(fā)展的方向演變,即M2型TAM,其在腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過程中的重要作用,已成為抗腫瘤治療的新熱點(diǎn)。本課題旨在通過檢測(cè)食管癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織中B7-H3、CD68和CD163蛋白的表達(dá),分析B7-H3表達(dá)、M2型TAM浸潤(rùn)與食管癌臨床病理資料的相關(guān)性。檢測(cè)不同食管癌細(xì)胞株Eca-109、TE-1、TE-13、KYSE-170細(xì)胞中B7-H3的表達(dá)水平,并通過靶向干擾B7-H3基因表達(dá)來研究Eca-109細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響。方法:1用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time reverse transcription-polymerase chain reaction,Real-time PCR)方法檢測(cè)HLA-DRa和CD163 m RNA在食管癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)水平;2用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)B7-H3、CD68和CD163蛋白在食管癌組織中的表達(dá)水平,并分析其表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系;3用Real-time PCR和Western blot方法檢測(cè)食管癌細(xì)胞株Eca-109、TE-1、TE-13、KYSE-170中B7-H3 m RNA和蛋白表達(dá)情況;4用Real-time PCR和Western blot方法檢測(cè)上調(diào)和下調(diào)B7-H3基因后,Eca-109細(xì)胞中B7-H3 m RNA和蛋白表達(dá)情況;5用Real-time PCR方法檢測(cè)上調(diào)和下調(diào)B7-H3基因的Eca-109細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后,巨噬細(xì)胞中HLA-DRa和CD163 m RNA表達(dá)情況;6用流式細(xì)胞分析技術(shù)(flow cytometry,FCM)檢測(cè)上調(diào)和下調(diào)B7-H3基因的Eca-109細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后,巨噬細(xì)胞表面HLA-DR、CD86、CD163和CD206蛋白的表達(dá)情況;7用ELISA方法檢測(cè)上調(diào)和下調(diào)B7-H3基因后,Eca-109細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6和M-CSF的分泌量;8用Western blot方法檢測(cè)上調(diào)和下調(diào)B7-H3基因的Eca-109細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后,巨噬細(xì)胞表面P-STAT3、STAT3和P-P65、P65蛋白表達(dá)情況;9用Real-time PCR方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞中分別加入STAT3通路抑制劑AG490和NF-κB通路抑制劑PDTC后,再分別與上調(diào)和下調(diào)B7-H3基因的Eca-109細(xì)胞共培養(yǎng),巨噬細(xì)胞中HLA-DRa和CD163 m RNA表達(dá)情況;10用FCM檢測(cè)巨噬細(xì)胞中分別加入STAT3通路抑制劑AG490和NF-κB通路抑制劑PDTC后,再分別與上調(diào)和下調(diào)B7-H3基因的Eca-109細(xì)胞共培養(yǎng),巨噬細(xì)胞表面HLA-DR、CD86、CD163和CD206蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:1 Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,30例食管癌組織中HLA-DRa(2.128±0.127)和CD163(5.696±0.136)m RNA的表達(dá)水平顯著高于對(duì)應(yīng)癌旁組織(1.000±0.000),差異具有顯著性意義(P0.01),食管癌組織中CD163 m RNA的表達(dá)水平顯著高于HLA-DRa,差異具有顯著性意義(P0.001)。2免疫組織化學(xué)分析結(jié)果顯示,70例食管癌組織中,B7-H3蛋白主要定位在腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)和胞膜,陽(yáng)性表達(dá)率為98.6%(69/70),明顯高于對(duì)應(yīng)癌旁組織的7.1%(5/70),χ2=117.41,P0.001;CD68和CD163蛋白大部分聚集在癌間質(zhì)巨噬細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜,呈灶狀或片狀分布。CD68陽(yáng)性表達(dá)率為91.4%(64/70),明顯高于對(duì)應(yīng)癌旁組織的18.6%(13/70),χ2=75.07,P0.001;而CD163陽(yáng)性表達(dá)率為84.3%(59/70),對(duì)應(yīng)癌旁組織中幾乎不表達(dá)。B7-H3表達(dá)與患者腫瘤浸潤(rùn)深度相關(guān),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。CD68表達(dá)與患者腫瘤浸潤(rùn)深度相關(guān),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。CD163表達(dá)與患者腫瘤大小及腫瘤浸潤(rùn)深度相關(guān),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3 Spearman相關(guān)性分析顯示,70例食管癌組織中B7-H3蛋白表達(dá)水平與CD68表達(dá)呈正相關(guān)(R=0.300,P0.05),與CD163表達(dá)也呈正相關(guān)(R=0.288,P0.05)。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示,食管癌組織中B7-H3、CD68和CD163蛋白呈高表達(dá)者總體生存率明顯低于低表達(dá)者,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4 Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,B7-H3 m RNA在食管癌Eca-109(0.449±0.037)、TE-1(0.488±0.027)、TE-13(1.000±0.000)和KYSE-170(0.297±0.016)細(xì)胞中均表達(dá),在TE-13中的表達(dá)量最高。Western blot結(jié)果顯示,B7-H3蛋白在TE-1(0.865±0.023)中呈中表達(dá),在KYSE-170(0.443±0.018)中呈低表達(dá),而在Eca-109(1.129±0.010)和TE-13(1.146±0.017)中呈高表達(dá),且兩者間的表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5 Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,Eca-109/B7-H3中B7-H3 m RNA表達(dá)水平明顯高于Eca-109/control[(1.624±0.055)vs(0.932±0.037),P0.01]及Eca-109組[(1.624±0.055)vs(1.000±0.000),P0.01];Eca-109/B7-H3 si RNA中B7-H3 m RNA表達(dá)水平明顯低于Eca-109/control si RNA[(0.295±0.067)vs(0.929±0.037),P0.01]及Eca-109組[(0.295±0.067)vs(1.000±0.000),P0.01]。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,Eca-109/B7-H3中B7-H3蛋白表達(dá)水平明顯高于Eca-109/control[(0.164±0.007)vs(0.092±0.002),P0.001]及Eca-109組[(0.164±0.007)vs(0.091±0.001),P0.001],Eca-109/B7-H3 si RNA中B7-H3蛋白表達(dá)水平明顯低于Eca-109/control si RNA[(0.028±0.001)vs(0.091±0.001),P0.001]及Eca-109組[(0.028±0.001)vs(0.091±0.001),P0.001]。6 Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與單獨(dú)培養(yǎng)巨噬細(xì)胞相比,Eca-109細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)48h后,巨噬細(xì)胞中CD163 m RNA表達(dá)增加[(1.645±0.062)vs(1.000±0.000),P0.001],HLA-DRa m RNA表達(dá)降低[(0.865±0.065)vs(1.000±0.000),P0.05],說明Eca-109細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化。Eca-109/B7-H3與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)48h后,巨噬細(xì)胞中CD163 m RNA表達(dá)水平明顯高于正常共培養(yǎng)體系[(2.606±0.128)vs(1.645±0.062),P0.001],HLA-DRa m RNA表達(dá)水平明顯低于正常共培養(yǎng)體系[(0.537±0.083)vs(0.865±0.065),P0.01],說明Eca-109/B7-H3能夠促使巨噬細(xì)胞向M2型極化。而Eca-109/B7-H3 si RNA與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)48h后,巨噬細(xì)胞中HLA-DRa m RNA表達(dá)水平明顯高于正常共培養(yǎng)體系[(1.753±0.073)vs(0.865±0.065),P0.001],CD163 m RNA表達(dá)水平明顯低于正常共培養(yǎng)體系[(0.544±0.049)vs(1.645±0.062),P0.001],說明Eca-109/B7-H3si RNA能夠逆轉(zhuǎn)巨噬細(xì)胞向M1型極化。7 FCM檢測(cè)結(jié)果顯示,與單獨(dú)培養(yǎng)巨噬細(xì)胞相比,Eca-109細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)48h后,巨噬細(xì)胞表面CD163[(36.400±1.353)vs(23.367±1.201),P0.001]和CD206[(26.367±1.210)vs(23.733±0.971),P0.05]蛋白表達(dá)增加,HLA-DR[(20.333±0.833)vs(23.400±0.755),P0.01]和CD86[(18.500±0.557)vs(21.633±0.833),P0.01]蛋白表達(dá)降低,說明Eca-109細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化。Eca-109/B7-H3與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)48h后,巨噬細(xì)胞表面CD163[(630.333±1.528)vs(36.400±1.353),P0.001]和CD206[(36.200±1.114)vs(26.367±1.210),P0.001]蛋白表達(dá)水平明顯高于正常共培養(yǎng)體系,HLA-DR[(11.167±0.850)vs(20.333±0.833),P0.001]和CD86[(10.867±0.611)vs(18.500±0.557),P0.001]蛋白表達(dá)水平明顯低于正常共培養(yǎng)體系,說明Eca-109/B7-H3能夠促使巨噬細(xì)胞向M2型極化。而Eca-109/B7-H3 si RNA與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)48h后,巨噬細(xì)胞表面HLA-DR[(241.667±1.528)vs(20.333±0.833),P0.001]和CD86[(64.567±0.850)vs(18.500±0.557),P0.001]蛋白表達(dá)水平明顯高于正常共培養(yǎng)體系,CD163[(17.467±0.907)vs(36.400±1.353),P0.01]和CD206[(13.533±1.069)vs(26.367±1.210),P0.001]蛋白表達(dá)水平明顯低于正常共培養(yǎng)體系,說明Eca-109/B7-H3 si RNA能夠逆轉(zhuǎn)巨噬細(xì)胞向M1型極化。8 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,Eca-109/B7-H3培養(yǎng)上清中IL-6[(38.713±1.991pg/ml)vs(26.267±1.560 pg/ml),P0.01]和M-CSF[(85.380±6.052 pg/ml)vs(59.600±4.733 pg/ml),P0.01]的分泌量明顯高于Eca-109細(xì)胞分泌量,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而Eca-109/B7-H3 si RNA培養(yǎng)上清中IL-6[(15.033±1.427 pg/ml)vs(26.267±1.560 pg/ml),P0.001]和M-CSF[(28.367±4.747 pg/ml)vs(59.600±4.733 pg/ml),P0.01]的分泌量明顯低于Eca-109細(xì)胞分泌量。9 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,Eca-109/B7-H3與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)48h后,巨噬細(xì)胞表面P-STAT3[(0.219±0.010)vs(0.097±0.008),P0.001]和STAT3[(1.539±0.026)vs(1.876±0.012),P0.001]蛋白表達(dá)水平明顯高于正常共培養(yǎng)體系;而Eca-109/B7-H3 si RNA與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)48h后,巨噬細(xì)胞表面P-P65[(0.257±0.007)vs(0.173±0.002),P0.001]和P65[(0.347±0.007)vs(0.292±0.009),P0.01]蛋白表達(dá)水平明顯高于正常共培養(yǎng)體系。10 Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,巨噬細(xì)胞中加入STAT3信號(hào)通路抑制劑AG490后與Eca-109/B7-H3共培養(yǎng)48h,巨噬細(xì)胞中CD163 m RNA表達(dá)水平明顯低于未加抑制劑組[(1.918±0.088)vs(2.606±0.128),P0.01],HLA-DRa m RNA表達(dá)水平略高于未加抑制劑組[(0.624±0.079)vs(0.537±0.083),P0.05],說明巨噬細(xì)胞中加入STAT3通路抑制劑AG490后,能抑制Eca-109/B7-H3促使巨噬細(xì)胞M2型極化的作用。而巨噬細(xì)胞中加入NF-κB通路抑制劑PDTC后與Eca-109/B7-H3 si RNA共培養(yǎng)48h,巨噬細(xì)胞中HLA-DRa m RNA表達(dá)水平明顯低于未加抑制劑組[(1.310±0.056)vs(1.753±0.073),P0.01],CD163 m RNA表達(dá)水平明顯高于未加抑制劑組[(1.185±0.134)vs(0.544±0.049),P0.01],說明巨噬細(xì)胞中加入NF-κB通路抑制劑PDTC后,能抑制Eca-109/B7-H3si RNA促使巨噬細(xì)胞M1型極化的作用。11 FCM檢測(cè)結(jié)果顯示,巨噬細(xì)胞中加入STAT3信號(hào)通路抑制劑AG490后與Eca-109/B7-H3共培養(yǎng)48h,巨噬細(xì)胞表面CD163[(70.367±0.862)vs(159.333±2.517),P0.001]和CD206[(60.967±1.301)vs(149.667±2.082),P0.001]蛋白表達(dá)水平明顯低于未加抑制劑組,HLA-DR[(60.433±1.026)vs(29.500±0.985),P0.001]和CD86[(24.767±0.551)vs(11.867±0.651),P0.001]蛋白表達(dá)水平明顯高于未加抑制劑組,說明巨噬細(xì)胞中加入STAT3通路抑制劑AG490后,能抑制Eca-109/B7-H3促使巨噬細(xì)胞M2型極化的作用。而巨噬細(xì)胞中加入NF-κB通路抑制劑PDTC后與Eca-109/B7-H3 si RNA共培養(yǎng)48h,巨噬細(xì)胞表面HLA-DR[(140.333±1.528)vs(238.667±3.512),P0.001]和CD86[(30.567±0.709)vs(49.433±0.709),P0.001]蛋白表達(dá)水平明顯低于未加抑制劑組,CD163[(31.700±0.755)vs(12.700±0.819),P0.001]和CD206[(25.500±0.656)vs(13.100±0.557),P0.001]蛋白表達(dá)水平明顯高于未加抑制劑組,說明巨噬細(xì)胞中加入NF-κB通路抑制劑PDTC后,能抑制Eca-109/B7-H3 si RNA促使巨噬細(xì)胞M1型極化的作用。結(jié)論:1共刺激分子B7-H3和M2型TAM標(biāo)記物CD68、CD163蛋白在人食管癌組織中高表達(dá),且與食管癌患者的進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān),有望成為監(jiān)測(cè)食管癌進(jìn)展的重要指標(biāo)。2靶向干擾B7-H3基因在體外能逆轉(zhuǎn)巨噬細(xì)胞的M2型極化,提示B7-H3基因可能參與調(diào)節(jié)食管癌腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞,為免疫治療提供潛在的治療靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2466396