【摘要】：目的:喉鱗狀細胞癌是最常見的頭頸部惡性腫瘤之一,病因尚不十分清楚,但常見的誘發(fā)因素有很多種,例如吸煙、飲酒、病毒感染、放射線、膳食習(xí)慣、職業(yè)因素等。喉癌的臨床治療目前以外科手術(shù)治療加以放化療為主,盡管可以延長部分患者的存活時間,但總體治療效果并不十分理想,后遺癥并發(fā)癥比較多,如嗆咳、失聲、吞咽困難等,嚴重影響了患者的生命質(zhì)量。為進一步深入了解喉癌的發(fā)生發(fā)展機制,以期望找到更有效和可選的分子靶點來預(yù)防疾病,并對其進行分子靶向治療,這是目前提高喉癌的診治水平和判斷預(yù)后的重要手段。本研究通過轉(zhuǎn)染IL-17基因,觀察Hep-2細胞功能的變化,探討白細胞介素-17(IL-17)對人喉癌細胞Hep-2增殖、凋亡和遷移的作用及可能存在的機制。方法:構(gòu)建IL-17重組真核表達載體pEGFP-N1-IL-17,將pEGFP-N1-IL-17瞬時轉(zhuǎn)染Hep-2細胞,同時設(shè)置空載體組(pEGFP-N1)和正常對照組。熒光顯微鏡觀察三組細胞的轉(zhuǎn)染情況。通過RT-PCR和Western blotting實驗分別檢測轉(zhuǎn)染前后各組細胞中IL-17 mRNA和蛋白的表達。MTT增殖實驗檢測轉(zhuǎn)染前后三組細胞增殖變化,同時應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染前后三組細胞凋亡的變化,通過RT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)染前后三組細胞各自凋亡相關(guān)分子Caspase-3、Caspase-9和Bcl-2的表達變化。細胞劃痕修復(fù)實驗和Transwell小室實驗分別觀察轉(zhuǎn)染前后三組細胞的橫向遷移和縱向遷移能力的變化,Transwell基質(zhì)膠實驗檢測轉(zhuǎn)染前后Hep-2細胞侵襲能力的變化,RT-PCR技術(shù)方法檢測細胞侵襲相關(guān)分子MMP-2和MMP-9的mRNA表達。Western blotting實驗檢測Notch信號通路相關(guān)分子Notch1、Hey1和Hes1的表達。結(jié)果:Hep-2細胞中沒有綠色熒光蛋白GFP的表達,即使有激發(fā)光的激發(fā),也不會出現(xiàn)綠色熒光。轉(zhuǎn)染了pEGFP-N1和pEGFP-N1-IL-17的Hep-2細胞,通過熒光顯微鏡可以看到綠色熒光,且隨著轉(zhuǎn)染時間延長,細胞轉(zhuǎn)染效率逐漸增加而熒光逐步增強。RT-PCR和Western blotting實驗結(jié)果顯示,在成功轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-IL-17的Hep-2/pEGFP-N1-IL-17細胞中,有IL-17 mRNA和蛋白的表達,正常的Hep-2細胞和轉(zhuǎn)染空載體pEGFP-N1的Hep-2/pEGFP-N1細胞均不表達IL-17。MTT細胞增殖實驗和流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡實驗發(fā)現(xiàn)目的基因IL-17可以抑制Hep-2細胞的增殖,促進Hep-2細胞的凋亡。RT-PCR實驗結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-IL-17后,凋亡相關(guān)分子Caspase-3、Caspase-9的表達量明顯升高,而Bcl-2的表達量明顯下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Caspase-3:F=289.52,P0.01;Caspase-9:F=20.70,P0.01;Bcl-2:F=287.05,P0.01)。細胞劃痕修復(fù)實驗、Transwell小室遷移和侵襲實驗結(jié)果表明,IL-17可以顯著抑制Hep-2細胞的遷移和侵襲能力(P0.01)。為了進一步探討IL-17發(fā)揮此作用的機制,RT-PCR檢測細胞侵襲相關(guān)分子MMP-2、MMP-9表達結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常對照組相比,轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-IL-17組MMP-2、MMP-9的表達量明顯下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(MMP-2:F=223.52,P0.01;MMP-9:F=722.46,P0.01)。Western blotting檢測Notch信號通路中的相關(guān)分子(Notch1、Hey1、Hes1)的表達。結(jié)果表明,和正常對照組相比,轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-IL-17組Notch1、Hey1、Hes1的表達均明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Notch1:F=176.68,P0.01;Hey1:F=265.96,P0.01;Hes1:F=131.11,P0.01)。結(jié)論:1 Hep-2細胞中不存在IL-17的表達。轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-IL-17可以抑制Hep-2細胞的增殖和促進Hep-2細胞的凋亡。可能是IL-17能夠促進凋亡相關(guān)分子Caspase-3和Caspase-9的表達同時抑制Bcl-2的表達實現(xiàn)的。2 IL-17能夠抑制侵襲相關(guān)分子MMP-2和MMP-9等的表達抑制Hep-2細胞的橫向遷移、縱向遷移和侵襲能力。3 IL-17對人喉癌Hep-2細胞的功能影響可能通過Notch信號通路的功能在起作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：濟南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R739.65

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本文編號：2464912