【摘要】：目的:通過(guò)構(gòu)建LIMK1高表達(dá)的人胃癌MGC803細(xì)胞,觀察LIMK1對(duì)羅格列酮(Rosiglitazone,ROS)抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的影響及其作用機(jī)制。方法:構(gòu)建含有高表達(dá)LIMK1的EX-C0763-M98-5真核表達(dá)載體并用其轉(zhuǎn)染MGC803細(xì)胞。用RT-PCR及Western blot驗(yàn)證ROS處理前后細(xì)胞中LIMK1 m RNA及蛋白的表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)、CCK-8法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwell小室遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ROS處理前后,過(guò)表達(dá)LIMK1對(duì)MGC803細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的作用。結(jié)果:1.成功地構(gòu)建了過(guò)表達(dá)LIMK1的EX-C0763-M98-5真核表達(dá)載體細(xì)胞。測(cè)序結(jié)果顯示成功構(gòu)建了EX-C0763-M98-5真核表達(dá)載體。用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MGC803細(xì)胞后,檢測(cè)細(xì)胞的綠色熒光提示成功轉(zhuǎn)染了MGC803細(xì)胞。RT-PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)顯示,EX-C0763-M98-5真核表達(dá)載體細(xì)胞中的LIMK1 m RNA與蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。而轉(zhuǎn)染空載體EX-NEG-M98的MGC803細(xì)胞與對(duì)照組相比,LIMK1的m RNA及蛋白表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。2.ROS對(duì)高表達(dá)LIMK1的MGC803細(xì)胞m RNA表達(dá)及蛋白表達(dá)的影響。RT-PCR及Western blot結(jié)果提示,ROS作用前,LIMK1高表達(dá)的MGC803細(xì)胞m RNA及蛋白表達(dá)高于對(duì)照組和空載體組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。ROS作用后,對(duì)照組和空載體組的m RNA及蛋白表降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而用ROS處理前后,過(guò)表達(dá)LIMK1的MGC803細(xì)胞m RNA及蛋白表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。3.ROS對(duì)高表達(dá)LIMK1的MGC803細(xì)胞增殖的影響CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示用ROS分別處理MGC803細(xì)胞1、2、3天后,MGC803細(xì)胞增殖率分別為34.84%、75.81%和80.16%(P0.05),而高表達(dá)LIMK1的MGC803細(xì)胞增殖率分別為66.59%、136.43%及245.52%(P0.05);ROS處理前后,過(guò)表達(dá)LIMK1的MGC803細(xì)胞活力無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.36)。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示,ROS作用前,LIMK1高表達(dá)的細(xì)胞的相對(duì)集落形成率37.3%,高于對(duì)照組25.3%和空載體組24.0%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。ROS作用后,對(duì)照組和空載體組的集落形成率分別下降為15.3%和14.7%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。而ROS處理前后,過(guò)表達(dá)LIMK1的MGC803細(xì)胞相對(duì)集落形成率與對(duì)照組相比無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.14)。4.ROS對(duì)高表達(dá)LIMK1的MGC803細(xì)胞周期的影響。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示,ROS處理前,LIMK1高表達(dá)MGC803細(xì)胞G2/M期百分率(%)25.27±2.53,高于對(duì)照組14.6±1.47和空載體組14.18±2.21,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);ROS處理后,對(duì)照組和空載體組G0/G1期百分率增高,分別為64.6±3.27與65.7±1.60,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),G2/M期百分率分別為8.95±0.65與8.61±1.31,而高表達(dá)組與ROS作用前后的無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5.ROS對(duì)高表達(dá)LIMK1的MGC803細(xì)胞遷移、侵襲的影響。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示,MGC803細(xì)胞遷移24h后,ROS處理前LIMK1高表達(dá)組穿膜細(xì)胞數(shù)196±7個(gè)大于MGC803組158±3個(gè)及空載體組160±4個(gè),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。ROS處理后,MGC803組和空載體組穿膜細(xì)胞減少,分別為69±1以及69±3個(gè),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而高表達(dá)LIMK1(導(dǎo)入外源性LIMK1)后,ROS處理過(guò)的MGC803細(xì)胞遷移能力恢復(fù)193±9個(gè)。侵襲實(shí)驗(yàn)顯示,MGC803細(xì)胞侵襲48h后,ROS處理前LIMK1高表達(dá)組穿膜細(xì)胞數(shù)112±1個(gè)大于MGC803組73±2個(gè)及空載體組76±2個(gè),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。ROS處理后,MGC803組和空載體組穿膜細(xì)胞減少,分別為47±1以及46±4個(gè),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而高表達(dá)LIMK1(導(dǎo)入外源性LIMK1)后,ROS處理過(guò)的MGC803細(xì)胞侵襲能力恢復(fù)110±2個(gè)。結(jié)論:1.LIMK1高表達(dá)可促進(jìn)MGC803細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。2.ROS能抑制MGC803細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。3.LIMK1可能是ROS抑制人胃癌MGC803細(xì)胞增殖、遷移及侵襲作用的靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.2

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本文編號(hào)：2463602