【摘要】：研究背景和目的:肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界范圍內(nèi)威脅人類生命的最為嚴(yán)重的疾病之一。傳統(tǒng)化療藥物缺乏腫瘤選擇性、毒副作用大、容易產(chǎn)生多藥耐藥效應(yīng)。至今,傳統(tǒng)方法對HCC的治療未取得實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。聲動力療法是一種新興的腫瘤治療方案。聲敏藥物在腫瘤部位富集后,施加匹配吸收波長的超聲波照射,能生成活性很強(qiáng)的單線態(tài)氧,產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。聲動力療法在腫瘤治療方面顯示出巨大的潛力。本文設(shè)計并構(gòu)建了一個結(jié)構(gòu)簡單的、具有生物相容性的多功能納米載藥系統(tǒng)HPDF,HPDF的結(jié)構(gòu)是卟啉類化合物血卟啉(HP)與蒽環(huán)類化療藥物阿霉素(DOX)通過π-π共軛作用形成的納米復(fù)合物,然后以兩親性嵌段共聚物Pluronic F68通過疏水作用包裹納米復(fù)合物形成親水外殼而構(gòu)成。本課題研究了F68對聲敏劑HP與化療藥物DOX的高效共載、腫瘤靶向遞送及其聯(lián)合聲動力與化療治療肝癌的效果和相關(guān)機(jī)制。研究方法:1.合成HP與DOX的納米復(fù)合物HPD,用Pluronic包裹形成納米藥物HPDF。通過透射電子顯微鏡、原子力顯微鏡及動態(tài)光散射研究其形貌、粒徑以及電位和體外穩(wěn)定性。高效液相色譜分析對藥物的體外釋放行為進(jìn)行檢測。2.運(yùn)用CCK-8法檢測不同處理組細(xì)胞中藥物半數(shù)抑制濃度和增殖情況的變化。流式細(xì)胞術(shù)定量檢測不同處理組細(xì)胞的藥物攝取量。活細(xì)胞成像和激光共聚焦觀察藥物在肝癌細(xì)胞中的藥物分布,轉(zhuǎn)移和亞細(xì)胞定位。熒光定量PCR技術(shù)檢測Nanog~(Neg)細(xì)胞和Nanog~(Pos)肝癌細(xì)胞中相關(guān)干性基因的表達(dá)。3.流式細(xì)胞術(shù)檢測不同處理組Hep G2細(xì)胞凋亡與周期變化以及細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成。激光共聚焦檢測線粒體膜電位的變化和細(xì)胞色素C的亞細(xì)胞定位,Western blot檢測線粒體凋亡以及核損傷相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。4.建立肝癌裸鼠皮下模型,使用Cy5.5熒光標(biāo)記納米復(fù)合藥物HPDF,小動物活體成像考察其腫瘤靶向性以及在裸鼠體內(nèi)的組織分布情況;冰凍切片觀察HPDF納米膠束中的DOX在心臟和腫瘤的累積。5.尾靜脈注射不同藥物對荷瘤小鼠進(jìn)行治療,繪制腫瘤生長曲線。HE染色檢測HPDF的生物安全性及其對腫瘤組織的殺傷作用;Masson三色染色法檢測不同處理組中腫瘤內(nèi)膠原沉積的情況。CD31免疫組化染色檢測不同處理組腫瘤內(nèi)血管的生長情況。研究結(jié)果:1.Pluronic F68包裹HPD形成的HPDF納米膠束平均直徑為87.9±10.8 nm,具有典型的核殼結(jié)構(gòu)和較好的體外穩(wěn)定性。在酸性環(huán)境下,HPDF實(shí)現(xiàn)了藥物p H敏感性釋放。2.與游離DOX相比,聯(lián)合超聲波照射時HPDF納米膠束能夠顯著增加Hep G2細(xì)胞內(nèi)ROS水平并在超聲處理12 h后達(dá)到最高值。游離DOX和HPDF納米膠束均能造成線粒體膜損傷和Cyt c的釋放。HPDF納米膠束聯(lián)合超聲照射處理展現(xiàn)出活化caspase-9、caspase-3、p53和Rad51的最高表達(dá)水平。3.HPDF納米粒子容易被Hep G2細(xì)胞攝取,通過逃逸溶酶體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核。與游離DOX相比,HPDF納米膠束聯(lián)合超聲照射的IC_(50)降低約5.5倍。流式結(jié)果表明,HPDF結(jié)合超聲波照射后可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期S期的阻滯。4.與Nanog~(Neg)細(xì)胞相比,Nanog~(Pos) CSCs干性相關(guān)基因Nanog,Oct4和Sox2的表達(dá)水平均顯著增高。與游離DOX相比,HPDF納米膠束聯(lián)合超聲照射的IC_(50)降低約10倍。HPDF納米膠束可以有效地將DOX遞送到具有耐藥性的Nanog~(Pos) CSCs中并提高DOX在細(xì)胞核中的積累。5.尾靜脈注射4 h后,HPDF/Cy5.5納米膠束開始在Hep G2荷瘤小鼠腫瘤中蓄積,在6-8 h內(nèi)達(dá)到最高水平,24 h后幾乎只能在腫瘤中觀察到。與游離DOX相比,由HPDF納米膠束遞送的DOX在荷瘤小鼠心臟中的分布顯著減少,在腫瘤中的蓄積量顯著增加。6.結(jié)合超聲波照射后,HPDF納米膠束幾乎能夠完全抑制腫瘤生長,同時Hep G2荷瘤小鼠主要器官中沒有觀察到可檢測的病理變化或損傷。經(jīng)過HPDF納米膠束和超聲輻射聯(lián)合治療的小鼠顯示出最低的腫瘤微血管密度和對腫瘤內(nèi)膠原沉積的最強(qiáng)的抑制作用。結(jié)論:本文設(shè)計并構(gòu)建了一種結(jié)構(gòu)簡單、具有良好生物相容性的多功能納米載藥系統(tǒng)HPDF,其可以實(shí)現(xiàn)HCC聲動力和化療的協(xié)同治療,在臨床腫瘤治療應(yīng)用上展示出巨大的潛力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

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本文編號：2462845