【摘要】：乳腺癌是現(xiàn)階段女性人群中發(fā)病率最高的惡性腫瘤,尤其在發(fā)達(dá)國(guó)家其發(fā)病率逐年上升,嚴(yán)重威脅著人類生命。作為癌癥惡性表型之一,腫瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制是制約著患者預(yù)后的桎梏,普遍存在于乳腺癌病例中。由于關(guān)于腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制尚未完全闡明,目前針對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移的特異性治療手段仍顯匱乏。由于乳腺癌淋巴系統(tǒng)豐富,前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移常發(fā)生于乳腺鄰近腋下淋巴結(jié)。已有研究表明腋下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生與乳腺癌患者不良預(yù)后密切相關(guān)。因此,術(shù)后的腋下淋巴結(jié)病理檢查對(duì)于乳腺癌患者是否需要接受術(shù)后輔助化療具有重要的臨床指導(dǎo)意義。近年來(lái),得益于鉬靶射線檢查被廣泛應(yīng)用于乳腺癌的早期診斷,極大地改善了乳腺癌的早起篩查及治療效果,為乳腺癌患者帶來(lái)了福音。不僅如此,由于鉬靶射線在探查腋窩淋巴結(jié)中的應(yīng)用,在臨床實(shí)踐中腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性的患者可以接受針對(duì)性的治療,不再盲目接受乳腺癌淋巴結(jié)廓清術(shù)。至從鉬靶射線在乳腺癌診斷中得到廣泛普及,乳腺癌淋巴結(jié)廓清術(shù)不再是浸潤(rùn)性乳腺癌的統(tǒng)一治療標(biāo)準(zhǔn)�？梢�(jiàn),探究預(yù)示早期乳腺癌腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分子靶標(biāo)對(duì)乳腺癌患者的臨床治療具有重要的參考價(jià)值。 microRNA (miRNA)是一類長(zhǎng)度約為22m的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子,廣泛存在于哺乳動(dòng)物中,在進(jìn)化過(guò)程中呈高度保守。miRNA在細(xì)胞內(nèi)通過(guò)組成RISC復(fù)合體特異性識(shí)別并結(jié)合到靶mRNA的3'UTR序列中的miRNA應(yīng)答元件(miRNA response element, MRE),從而介導(dǎo)靶mRNA分子以及其他轉(zhuǎn)錄物的降解或翻譯受阻,藉此在細(xì)胞的增殖分化、代謝和凋亡等重要細(xì)胞生理活動(dòng)中扮演重要角色。據(jù)推測(cè)在人類細(xì)胞中多達(dá)60%的基因受microRNA的調(diào)控,迄今人們已發(fā)現(xiàn)的microRNA超過(guò)1900種。近年來(lái)多項(xiàng)有關(guān)miRNA與腫瘤相關(guān)性的研究中,人們檢測(cè)到乳腺癌組織中多種miRNA異常表達(dá),并且某些miRNA還與患者預(yù)后密切相關(guān)。目前已有越來(lái)越多的研究表明microRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用。利用生物信息學(xué)手段,檢測(cè)microRNA表達(dá)譜,可以將腫瘤準(zhǔn)確的歸類于不同的病理亞型及不同階段�？梢�(jiàn),microRNA通過(guò)調(diào)控靶基因的表達(dá)水平在乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制中扮演著重要角色,研究miRNA對(duì)靶基因的調(diào)控機(jī)制對(duì)開(kāi)發(fā)針對(duì)乳腺癌的早期診斷,預(yù)后評(píng)估及治療手段的靶標(biāo)具有重要的臨床意義。然而迄今為止,乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)特異性microRNA表達(dá)譜尚未得到充分闡明。本研究中我們采用了通過(guò)生物信息學(xué)手段建立乳腺癌腋窩淋巴結(jié)相關(guān)特異性microR NA表達(dá)譜,通過(guò)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析,篩選乳腺癌腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)microRNA分子。在73例乳腺癌患者組織樣本中檢測(cè)候選microRNA分子的表達(dá)水平,驗(yàn)證這些microRNA與乳腺癌腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性。此外,鑒于目前三陰乳腺癌的診療成為乳腺癌領(lǐng)域中的熱點(diǎn)問(wèn)題,我們檢測(cè)了Her-2/neu, ER及PR的表達(dá)情況,并與候選microRNA的表達(dá)水平進(jìn)行匹配分析。 收集2011年12月和2012年3月期間在我院行乳腺癌根治術(shù)的73例臨床組織樣本(31例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例及42例未發(fā)生過(guò)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例),根據(jù)是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)行分組,即淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(N=31)及未轉(zhuǎn)移組(N=42),入組患者年齡38-65歲之間,中位數(shù)為49,且均為女性。兩組樣本收集完成后立即凍存于液氮,直至提取RNA。本研究中涉及的臨床相關(guān)性實(shí)驗(yàn)均得到吉林大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會(huì)的許可,并征得患者知情同意書。該研究所用的標(biāo)本所屬患者均無(wú)術(shù)前放、化療史。利用microRNA芯片技術(shù)高通量檢測(cè)microRNA表達(dá)譜改變情況,進(jìn)行兩組之間的對(duì)比,并將Her-2是否陽(yáng)性作為變量與microRNA表達(dá)情況進(jìn)行對(duì)比。提取樣本組織中總RNA,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后,對(duì)(miR-185-5P, miR-339-5p, miR-542-5P, miR-3923)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR,從而驗(yàn)證這些miRNA表達(dá)的。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,對(duì)microRNA表達(dá)水平與臨床病理特征之間的關(guān)系相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 在試驗(yàn)方法上我們采用mirVanaTM miRNA Isolation Kit (Cat. No. AM1560; Ambion, Austin, TX, USA),按照廠商提供的說(shuō)明書及操作指南進(jìn)行RNA提取分離及純化,并通過(guò)Agilent生物分析儀2100(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)檢測(cè)RIN數(shù)由,進(jìn)行RNA質(zhì)檢。microRNA芯片是Agilent human miRNA array (8*60K, version16.0; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA),其中包含針對(duì)在數(shù)據(jù)庫(kù)中的miRBase注冊(cè)的1205人的microRNA序列(ROM捕獲探針www.mirbase.org)。按昭miRNA Complete Labeling and Hyb Kit (Cat. No.5190-0456; Agilent Technologies)的操作指南在55℃條件下進(jìn)行RNA雜交,離心20rpm,20小時(shí)。雜交后, staining dishes (Cat. No.121; Thermo Shandon, Waltham, MA, USA)進(jìn)行染色,并在Gene Expression Wash Buffer Kit (Cat. No.5188-5327; Agilent Technologies)清洗。最后應(yīng)用Feature Extraction software10.7(Agilent Technologies)及Raw data were normalized by Quantile algorithm, Gene Spring Software11.0(Agilent Technologies)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化分子。使用SYBR綠色熒光標(biāo)記的實(shí)時(shí)RT-PC R檢測(cè)在microRNA array中表達(dá)呈顯著差異的microRNA分子。將50μg的總RNA用microRNA的cDNA合成試劑盒(Takara Life Technologies, Japan)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。用nicroRNA序列特異性引物(Takara Life Technologies Inc, Japan)進(jìn)行單個(gè)microRNA的表達(dá)水平的測(cè)定。所使用的RT-PCR條件為：95℃30sec,95℃10sec,60℃25sec,35cycles。計(jì)算出相對(duì)內(nèi)參的2-△△Ct值,對(duì)microRNA的表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)定量。人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231購(gòu)自ATCC。培養(yǎng)于含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基(HyClone, USA),(?)入雙抗：100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素,在在37℃、濕潤(rùn)、含有5%CO2密閉條件下培養(yǎng)。細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中呈貼壁生長(zhǎng)。下面分別從廣州Ribo-Bio生物科技有限公司購(gòu)買,microRNA類似物,microRNA空白對(duì)照及陰性對(duì)照microRNA, microRNA的抑制劑,具有互補(bǔ)序列的成熟microRNA,陰性對(duì)照的microRNA抑制劑。乳腺癌細(xì)胞系n(?)DA-MB-231以3×105/孔的密度接種于6孔板中,培養(yǎng)過(guò)夜。然后將細(xì)胞用20nM的類似物(miR-339-5p、miR-3923的類似物)或40nM的抑制劑(miR-185-5p和miR-542-5p的抑制劑)應(yīng)用Lipofectamine2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染制造商的指示。48小時(shí)后,進(jìn)行定量RT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率并進(jìn)行transwell小室試驗(yàn)觀察細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。應(yīng)用Matrigel invasion assay (Becton Dickinson, Bedford, MA, USA)進(jìn)行Transwell侵襲試驗(yàn)。所用8m m大小的transwell室插入物涂覆有基質(zhì)膠的1mg/ml的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基。細(xì)胞用胰蛋白酶處理,以每孔1×105個(gè)細(xì)胞密度,加入到3個(gè)復(fù)孔中。Franswell小的下部腔室中用750ml含0.5%血清作為趨化因子的培養(yǎng)基填充,在shRNA轉(zhuǎn)染后,并使其在37℃下孵育48小時(shí)。在通過(guò)濾膜的細(xì)胞進(jìn)入下層,侵入matrigel膠,戊二醛進(jìn)行固定,并用結(jié)晶紫染色,拍照記錄。實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理,應(yīng)用Excel作圖,用F檢驗(yàn)首先進(jìn)行方差分析,以t檢驗(yàn)判斷差異顯著性。 通過(guò)微陣列分析我們發(fā)現(xiàn)共有17個(gè)microRNA的表達(dá)水平在兩組患者組織中呈顯著性差異。與非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的患者組織相比,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中miR-206, miR-3923, miR-181A, miR-92A, miR-421, miR-339-5p, miR-3196, miR-29b等表達(dá)水平顯著下調(diào)(超過(guò)1.5倍),而miR-542-5p, miR-200a, miR-564, miR-451, miR-30c, miR-200b, miR-191-3P,miR-142-5p以及miR-185-5p等microRNA分子則呈高表達(dá)狀態(tài)。其中miR-185-5p, miR-542-5p, miR-339-5p和miR-3923等4個(gè)microRNA分子的表達(dá)呈顯著性差異。其中miR-185-5p, miR-542-5p的表達(dá)水平在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中顯著高表達(dá)(P=0.002和P=0.000),而1niR-339-5p(?)miR-3923的表達(dá)水平在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組顯著下調(diào)(P=0.000和P=0.000)。為了在體外水平觀察候選microRNA分子在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中的功能,我們應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)候選microRN A在乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)水平,結(jié)果表明,miR-339-5p和miR-3923在MDA-MB-231細(xì)胞中顯著低表達(dá)(分別為P=0.002和P=0.001),而miR-542-5p在4DA-MB-231細(xì)胞中顯著高表達(dá)(P=0.026)。miR-185-5p在不同臨床分期的患者之間的表達(dá)不同,但并無(wú)顯著性差異(采用Mann-Whitney U檢驗(yàn),P=0.051)。為了研究這些microRNA是否能影響乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力我們進(jìn)行了Transwe11試驗(yàn)。結(jié)果表明,miR-339-5p和miR-3923的體外高表達(dá)顯著抑制IDA-MB-231細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。在該研究中一些microRNA的表達(dá)與其他臨床病理特征,包括腫瘤大小,臨床分期,絕經(jīng)狀態(tài),ER,PR,HER2表達(dá)情況無(wú)明顯相關(guān)性(采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn), P0.05)。 綜上,我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-185-5p, miR-542-5p, miR-339-5p和miR-3923等microRNA的表達(dá)水平與乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),作為乳腺癌的預(yù)后評(píng)估靶標(biāo),具有重要的臨床指導(dǎo)意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.9

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2460134