【摘要】：背景： 肝細胞肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)在我國消化系統(tǒng)惡性腫瘤中屬于高發(fā)腫瘤。我國是乙肝感染大國,這就造成了每年我國HCC的新增病例和死亡人數(shù)均居世界首位。然而由于肝癌發(fā)病比較隱蔽,惡性度高,進展很快,這些特性造成肝癌預后極差,給人民的健康和社會經(jīng)濟帶來沉重負擔。近年來隨著醫(yī)學事業(yè)的發(fā)展,肝癌治療觀念不斷更新,以手術為主的綜合治療策略在一定程度上提高了肝癌患者生存率。特別是近年來以肝移植為代表的新的治療方式的出現(xiàn)為徹底根治肝癌提供了可能,然而由于術后肝癌的復發(fā)轉移大大阻礙了肝移植病人的中長期存活。因此,尋找更有效的肝癌移植預后分子標志物,探討其在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制將會有效地提高肝癌患者的長期生存率。目的： 本研究旨在利用蛋白質組學雙向電泳技術篩選肝癌肝移植術后復發(fā)病人HCC組織與未復發(fā)肝癌肝移植病人HCC組織間差異表達的蛋白質,通過生物信息學分析以及文獻檢索尋找出與肝癌肝移植病人術后復發(fā)以及與HCC復發(fā)轉移可能密切相關的潛在分子標志物。對篩選出的潛在分子標記物RBBP4首先在多樣本肝癌肝切病人及肝癌肝移植病人HCC組織和配對癌旁組織進行表達驗證,分析其與移植病人臨床病理參數(shù)以及肝病人預后的關系。最后通過分子生物學和細胞生物學技術,進一步明確RBBP4在HCC細胞株中的生物學功能,探究其在HCC復發(fā)轉移中的可能分子機制。 方法： 1.利用雙向電泳聯(lián)合質譜技術(two-dimensional gel electrophoresis combined mass spectrum,2D-MS)篩選肝癌肝移植術后復發(fā)病人HCC組織與移植術后未復發(fā)病人HCC組織間差異表達蛋白,并鑒定。 2.收集30例HCC患者肝癌肝切病人腫瘤及配對癌旁冰凍組織,以及70例肝癌肝移植病人腫瘤及配對癌旁石蠟組織,利用Western免疫印跡、實時熒光定量PCR、免疫組化等技術驗證差異表達蛋白視網(wǎng)膜母細胞瘤結合蛋白4(RBBP4)在’HCC腫瘤組織及配對癌旁組織中的表達情況。同時檢測RBBP4在其他類型肝組織(包括正常肝組織、肝硬化組織、轉移性肝癌組織、轉移淋巴結組織)中的表達情況。 3.根據(jù)免疫組化結果分析RBBP4與肝癌肝移植病人臨床病理參數(shù)以及病人總體及無瘤生存之間的關系。 4.利用免疫組化檢測RBBP4在不同腫瘤類型癌和癌旁組織中的表達,明確RBBP4表達變化是否具有普遍的意義。然后通過構建穩(wěn)定轉染RBBP4干擾及過表達BEL7402和HepG2肝癌細胞株,利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)、流式細胞凋亡實驗、Transwell細胞侵襲轉移實驗檢測RBBP4在調(diào)控肝癌細胞增殖、侵襲轉移以及凋亡中的作用。通過體外克隆形成實驗和在體裸鼠瘤體生成實驗觀察RBBP4對HCC細胞體內(nèi)外成瘤能力的影響。 5.利用microRNA靶基因預測網(wǎng)站結合熒光雙報告實驗尋找調(diào)控RBBP4異常表達的上游microRNA。并利用Western blot,實時熒光定量PCR技術尋找RBBP4調(diào)控的下游分子,來探索RBBP4在肝癌復發(fā)轉移中的分子機制。 結果： 1.本實驗中,通過2D-MS分析發(fā)現(xiàn)RBBP4在肝癌肝移植復發(fā)病人癌組織中的表達比未復發(fā)病人要高(倍數(shù)改變≥2.0倍,p0.05) 2. Western蛋白印跡結果證明RBBP4蛋白在HCC組織中表達水平明顯高于配對癌旁組織,實時熒光定量PCR結果也表明RBBP4mRNA水平在HCC組織中表達明顯高于配對癌旁組織(p=0.014)。免疫組化結果分析提示RBBP4表達在正常肝、肝硬化、肝癌組織中表達逐漸升高,并且RBBP4在肝癌轉移癌組織以及轉移的淋巴結組織中也有很高的表達。 3.根據(jù)免疫組化結果,臨床資料統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)RBBP4蛋白表達水平與肝癌肝移植患者血管侵襲(p=0.027)、腫瘤大小(p=0.01)、pTNM分期(p=0.002)及腫瘤復發(fā)(p=0.000)密切相關,與患者性別、年齡、腫瘤數(shù)目、甲胎蛋白(AFPA)水平、組織學分級等無關。Kaplan-Mier法分析發(fā)現(xiàn)RBBP4高表達患者無瘤生存與總體生存明顯低于RBBP4低表達組。Cox多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)RBBP4是肝癌肝移植術后腫瘤復發(fā)的獨立危險因素(HR=5.425；95%CI=1.803-16.324,p=0.003)。 4.通過進一步的免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)RBBP4在食管癌、結腸癌、肺癌、胰腺癌、肝癌膽管癌中的表達普遍升高。體外細胞功能學實驗表明干擾RBBP4表達后,肝癌細胞的增殖能力、侵襲轉移能力以及抗凋亡能力降低,而細胞過表達RBBP4后,肝癌細胞的增殖能力、侵襲能力以及抗凋亡能力升高。裸鼠體內(nèi)成瘤實驗表明,干擾RBBP4能夠明顯減弱肝癌細胞的體內(nèi)成瘤能力。 5.進一步的分子機制研究證明RBBP4是miR-199a-5p的靶基因,RBBP4的異常升高可能由于miR-199a-5p的表達降低。而RBBP4升高能夠通過抑制PTEN表達而激活AKT蛋白,AKT蛋白的活化則又進一抑制了miR-199a-5p的轉錄。因此我們在肝癌中發(fā)現(xiàn)了一條miR-199a-5p/RBBP4/AKT環(huán)路,這條環(huán)路的激活促進了肝癌的惡性進展。 結論： 1.相對于未復發(fā)肝癌肝移植病人,RBBP4在肝癌肝移植術后復發(fā)病人中的蛋白表達明顯升高,這一結果提示RBBP4可能與肝癌肝移植術后腫瘤復發(fā)相關； 2.肝癌肝移植病人RBBP4高表達者,其預后要明顯差于RBBP4低表達肝癌肝移植患者。RBBP4可能是肝癌肝移植術后腫瘤復發(fā)預測的潛在分子標志物； 3. RBBP4在正常肝,肝硬化,肝癌組織中表達逐漸升高,同時RBBP4在多種類型腫瘤中表達普遍升高,提示RBBP4在腫瘤發(fā)生發(fā)展中可能具有重要意義； 4.在肝癌中存在一條miR-199a-5p/RBBP4/AKT正反饋環(huán)路促進肝癌的發(fā)生發(fā)展。
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【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7

【參考文獻】

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本文編號：2458900