【摘要】：背景： 肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)在我國消化系統(tǒng)惡性腫瘤中屬于高發(fā)腫瘤。我國是乙肝感染大國,這就造成了每年我國HCC的新增病例和死亡人數(shù)均居世界首位。然而由于肝癌發(fā)病比較隱蔽,惡性度高,進(jìn)展很快,這些特性造成肝癌預(yù)后極差,給人民的健康和社會經(jīng)濟(jì)帶來沉重負(fù)擔(dān)。近年來隨著醫(yī)學(xué)事業(yè)的發(fā)展,肝癌治療觀念不斷更新,以手術(shù)為主的綜合治療策略在一定程度上提高了肝癌患者生存率。特別是近年來以肝移植為代表的新的治療方式的出現(xiàn)為徹底根治肝癌提供了可能,然而由于術(shù)后肝癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移大大阻礙了肝移植病人的中長期存活。因此,尋找更有效的肝癌移植預(yù)后分子標(biāo)志物,探討其在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制將會有效地提高肝癌患者的長期生存率。目的： 本研究旨在利用蛋白質(zhì)組學(xué)雙向電泳技術(shù)篩選肝癌肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)病人HCC組織與未復(fù)發(fā)肝癌肝移植病人HCC組織間差異表達(dá)的蛋白質(zhì),通過生物信息學(xué)分析以及文獻(xiàn)檢索尋找出與肝癌肝移植病人術(shù)后復(fù)發(fā)以及與HCC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移可能密切相關(guān)的潛在分子標(biāo)志物。對篩選出的潛在分子標(biāo)記物RBBP4首先在多樣本肝癌肝切病人及肝癌肝移植病人HCC組織和配對癌旁組織進(jìn)行表達(dá)驗證,分析其與移植病人臨床病理參數(shù)以及肝病人預(yù)后的關(guān)系。最后通過分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù),進(jìn)一步明確RBBP4在HCC細(xì)胞株中的生物學(xué)功能,探究其在HCC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中的可能分子機制。 方法： 1.利用雙向電泳聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)(two-dimensional gel electrophoresis combined mass spectrum,2D-MS)篩選肝癌肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)病人HCC組織與移植術(shù)后未復(fù)發(fā)病人HCC組織間差異表達(dá)蛋白,并鑒定。 2.收集30例HCC患者肝癌肝切病人腫瘤及配對癌旁冰凍組織,以及70例肝癌肝移植病人腫瘤及配對癌旁石蠟組織,利用Western免疫印跡、實時熒光定量PCR、免疫組化等技術(shù)驗證差異表達(dá)蛋白視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤結(jié)合蛋白4(RBBP4)在’HCC腫瘤組織及配對癌旁組織中的表達(dá)情況。同時檢測RBBP4在其他類型肝組織(包括正常肝組織、肝硬化組織、轉(zhuǎn)移性肝癌組織、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織)中的表達(dá)情況。 3.根據(jù)免疫組化結(jié)果分析RBBP4與肝癌肝移植病人臨床病理參數(shù)以及病人總體及無瘤生存之間的關(guān)系。 4.利用免疫組化檢測RBBP4在不同腫瘤類型癌和癌旁組織中的表達(dá),明確RBBP4表達(dá)變化是否具有普遍的意義。然后通過構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染RBBP4干擾及過表達(dá)BEL7402和HepG2肝癌細(xì)胞株,利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)、流式細(xì)胞凋亡實驗、Transwell細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移實驗檢測RBBP4在調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移以及凋亡中的作用。通過體外克隆形成實驗和在體裸鼠瘤體生成實驗觀察RBBP4對HCC細(xì)胞體內(nèi)外成瘤能力的影響。 5.利用microRNA靶基因預(yù)測網(wǎng)站結(jié)合熒光雙報告實驗尋找調(diào)控RBBP4異常表達(dá)的上游microRNA。并利用Western blot,實時熒光定量PCR技術(shù)尋找RBBP4調(diào)控的下游分子,來探索RBBP4在肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中的分子機制。 結(jié)果： 1.本實驗中,通過2D-MS分析發(fā)現(xiàn)RBBP4在肝癌肝移植復(fù)發(fā)病人癌組織中的表達(dá)比未復(fù)發(fā)病人要高(倍數(shù)改變≥2.0倍,p0.05) 2. Western蛋白印跡結(jié)果證明RBBP4蛋白在HCC組織中表達(dá)水平明顯高于配對癌旁組織,實時熒光定量PCR結(jié)果也表明RBBP4mRNA水平在HCC組織中表達(dá)明顯高于配對癌旁組織(p=0.014)。免疫組化結(jié)果分析提示RBBP4表達(dá)在正常肝、肝硬化、肝癌組織中表達(dá)逐漸升高,并且RBBP4在肝癌轉(zhuǎn)移癌組織以及轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織中也有很高的表達(dá)。 3.根據(jù)免疫組化結(jié)果,臨床資料統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)RBBP4蛋白表達(dá)水平與肝癌肝移植患者血管侵襲(p=0.027)、腫瘤大小(p=0.01)、pTNM分期(p=0.002)及腫瘤復(fù)發(fā)(p=0.000)密切相關(guān),與患者性別、年齡、腫瘤數(shù)目、甲胎蛋白(AFPA)水平、組織學(xué)分級等無關(guān)。Kaplan-Mier法分析發(fā)現(xiàn)RBBP4高表達(dá)患者無瘤生存與總體生存明顯低于RBBP4低表達(dá)組。Cox多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)RBBP4是肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的獨立危險因素(HR=5.425；95%CI=1.803-16.324,p=0.003)。 4.通過進(jìn)一步的免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)RBBP4在食管癌、結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌、肝癌膽管癌中的表達(dá)普遍升高。體外細(xì)胞功能學(xué)實驗表明干擾RBBP4表達(dá)后,肝癌細(xì)胞的增殖能力、侵襲轉(zhuǎn)移能力以及抗凋亡能力降低,而細(xì)胞過表達(dá)RBBP4后,肝癌細(xì)胞的增殖能力、侵襲能力以及抗凋亡能力升高。裸鼠體內(nèi)成瘤實驗表明,干擾RBBP4能夠明顯減弱肝癌細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力。 5.進(jìn)一步的分子機制研究證明RBBP4是miR-199a-5p的靶基因,RBBP4的異常升高可能由于miR-199a-5p的表達(dá)降低。而RBBP4升高能夠通過抑制PTEN表達(dá)而激活A(yù)KT蛋白,AKT蛋白的活化則又進(jìn)一抑制了miR-199a-5p的轉(zhuǎn)錄。因此我們在肝癌中發(fā)現(xiàn)了一條miR-199a-5p/RBBP4/AKT環(huán)路,這條環(huán)路的激活促進(jìn)了肝癌的惡性進(jìn)展。 結(jié)論： 1.相對于未復(fù)發(fā)肝癌肝移植病人,RBBP4在肝癌肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)病人中的蛋白表達(dá)明顯升高,這一結(jié)果提示RBBP4可能與肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)； 2.肝癌肝移植病人RBBP4高表達(dá)者,其預(yù)后要明顯差于RBBP4低表達(dá)肝癌肝移植患者。RBBP4可能是肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)預(yù)測的潛在分子標(biāo)志物； 3. RBBP4在正常肝,肝硬化,肝癌組織中表達(dá)逐漸升高,同時RBBP4在多種類型腫瘤中表達(dá)普遍升高,提示RBBP4在腫瘤發(fā)生發(fā)展中可能具有重要意義； 4.在肝癌中存在一條miR-199a-5p/RBBP4/AKT正反饋環(huán)路促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2458900