【摘要】：肺癌是世界上致死率最高的惡性腫瘤,非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占全部肺癌病例85%以上,是最常見的肺癌類型,研究NSCLC發(fā)生發(fā)展的機(jī)理一直是本領(lǐng)域的重點(diǎn)和難點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)研究手段的進(jìn)步,人們已經(jīng)意識(shí)到NSCLC不再是一種疾病,而是一類由特定基因驅(qū)動(dòng)的異質(zhì)性疾病,過去一塵不變的治療模式已經(jīng)不能適應(yīng)個(gè)體化治療的需求,以表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)和ROS1激酶為代表的靶向治療引領(lǐng)NSCLC精準(zhǔn)醫(yī)療時(shí)代的到來,吉非替尼、厄洛替尼和克唑替尼等一系列酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors,TKIs)顯著改善了NSCLC患者預(yù)后,極大的提高了患者生活質(zhì)量,是過去十年腫瘤臨床治療和基礎(chǔ)研究的重大突破。不幸的是幾乎所有患者在接受TKIs治療一段時(shí)間后耐藥復(fù)發(fā),嚴(yán)重影響了TKIs的長(zhǎng)期療效和臨床應(yīng)用,因此闡明TKIs耐藥的分子機(jī)制、制定克服耐藥的治療策略、盡最大可能推遲耐藥現(xiàn)象出現(xiàn)是臨床醫(yī)生和科學(xué)家共同面臨的難題和挑戰(zhàn)。TKIs耐藥原因尚未完全解析,以EGFR TKIs獲得性耐藥為例,仍有約20%患者耐藥機(jī)制不清,這部分患者也沒有切實(shí)有效的耐藥后治療方案。多環(huán)芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor,Ah R)是一個(gè)受配體活化的胞內(nèi)受體,在過去的近40年里人們一直認(rèn)為Ah R信號(hào)通路活化后轉(zhuǎn)錄激活下游代謝酶,其全部功能由轉(zhuǎn)錄因子活性介導(dǎo);近些年研究發(fā)現(xiàn)Ah R還有一些生物學(xué)功能不依賴其轉(zhuǎn)錄活性,且Ah R調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡、周期轉(zhuǎn)化等新功能與代謝酶表達(dá)無關(guān)。Ah R在多種實(shí)體瘤組織和細(xì)胞系中過度表達(dá),回顧性研究提示Ah R表達(dá)水平與腫瘤惡性程度正相關(guān)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)Ah R蛋白在TKIs耐藥的患者標(biāo)本中表達(dá)亦增加,但其意義并不清楚。本文揭示了Ah R蛋白負(fù)向調(diào)控NSCLC TKIs敏感性的作用,提出活化的Ah R作為銜接蛋白(adaptor protein)招募Src和Jak2兩種激酶,形成的Jak2-Ah R-Src復(fù)合物可以繞過EGFR旁路活化下游PI3K/Akt和MEK/Erk信號(hào)通路導(dǎo)致TKIs耐藥;在高表達(dá)內(nèi)源性Ah R蛋白的耐藥細(xì)胞用藥物或sh RNA抑制Ah R可以逆轉(zhuǎn)TKIs耐藥性,而在敏感細(xì)胞過表達(dá)Ah R則導(dǎo)致TKIs耐藥性;此外,Ah R與Src和Jak2蛋白相互作用不依賴其轉(zhuǎn)錄因子活性,活化的Ah R瞬時(shí)轉(zhuǎn)位到近膜側(cè),攜帶胞漿內(nèi)Src蛋白與Jak2結(jié)合,促使Jak2磷酸化Src,Jak2 TKIs和Src TKIs可以阻斷Ah R蛋白介導(dǎo)的激酶旁路。本研究發(fā)現(xiàn)Ah R蛋白招募激酶的新功能,闡明了TKIs耐藥患者Ah R表達(dá)增加的意義及其導(dǎo)致耐藥的分子機(jī)制,為克服EGFR TKIs耐藥提供新的思路。方法:(1)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)和組織芯片分析Ah R在m RNA和蛋白水平與NSCLC惡性程度、淋巴結(jié)侵犯和患者預(yù)后的相關(guān)性。(2)構(gòu)建野生型Ah R(Ah R WT)和組成型活化Ah R(Ah R CA)表達(dá)載體和sh RNA,包裝慢病毒感染細(xì)胞,MTT、平板克隆、Western blot、IHC、TUNEL染色等實(shí)驗(yàn)研究上調(diào)和下調(diào)Ah R對(duì)EGFR TKIs敏感性的影響。(3)構(gòu)建入核信號(hào)缺失的Ah RΔNLS突變體,sh RNA下調(diào)ARNT、cyp1a1和cyp1b1表達(dá),檢測(cè)Ah R轉(zhuǎn)錄活性對(duì)EGFR TKIs敏感性的影響。(4)慢病毒感染細(xì)胞過表達(dá)Src或sh RNA下調(diào)Src,使用Src TKIs抑制其激酶活性,MTT、Western blot、IHC等實(shí)驗(yàn)研究Src在Ah R信號(hào)通路活化導(dǎo)致EGFR TKIs耐藥中的作用。(5)蛋白激酶芯片篩選引起Src磷酸化的激酶,HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染Jak2、Src和Ah R質(zhì)粒,IP和Western blot實(shí)驗(yàn)研究Ah R和Jak2/Src激酶的相互作用。結(jié)果:(1)Ah R在m RNA水平與NSCLC級(jí)別和預(yù)后無明顯相關(guān)性,相反,Ah R在蛋白水平表達(dá)越高,腫瘤侵襲性越強(qiáng),患者預(yù)后越差。Western blot結(jié)果顯示TKIs耐藥細(xì)胞Ah R蛋白表達(dá)亦增加。(2)Ah R抑制劑α-NF或sh RNA下調(diào)Ah R,細(xì)胞學(xué)水平表達(dá)增敏EGFR TKIs,阻斷下游PI3K/Akt和MEK/Erk信號(hào)通路,在裸鼠體內(nèi)明顯抑制瘤體體積,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。(3)慢病毒過表達(dá)Ah R WT或配體活化Ah R信號(hào)通路導(dǎo)致敏感細(xì)胞EGFR TKIs耐藥,Western blot顯示細(xì)胞Akt和Erk磷酸化水平增加且不能被EGFR TKIs抑制,然而過表達(dá)Ah R CA則不能誘導(dǎo)耐藥,不增加Akt和Erk磷酸化水平。(4)突變Ah R入核信號(hào)NLS,sh RNA下調(diào)ARNT,cyp1a1和cyp1b1,去除Ah R轉(zhuǎn)錄因子活性并不影響Ah R上述效應(yīng),說明Ah R引起耐藥的作用與其靶基因轉(zhuǎn)錄無關(guān)。(5)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和體內(nèi)外功能學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示Src激酶活化是Ah R導(dǎo)致耐藥的關(guān)鍵事件,Ah R通過其SH2結(jié)合模體招募Src并促進(jìn)Y416位點(diǎn)磷酸化,旁路活化下游PI3K/Akt和MEK/Erk信號(hào)通路。Src TKIs或Src sh RNA聯(lián)合EGFR TKIs可以阻斷持續(xù)性活化的PI3K/Akt和MEK/Erk信號(hào)通路,體外抑制細(xì)胞增殖,體內(nèi)減少Ki67陽性細(xì)胞比例,克服EGFR TKIs耐藥。(6)蛋白激酶芯片結(jié)果強(qiáng)烈提示Jak2磷酸化下游激酶的作用,IP實(shí)驗(yàn)顯示活化Ah R信號(hào)通路促進(jìn)Ah R蛋白瞬時(shí)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞近膜側(cè),招募Jak2和Src兩個(gè)激酶,使下游PI3K/Akt和MEK/Erk通路活化,Jak2 TKIs和Jak2 sh RNA抑制Src磷酸化,克服Ah R活化導(dǎo)致的EGFR TKIs耐藥。結(jié)論:總結(jié)整個(gè)課題,我們發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的EGFR TKIs耐藥機(jī)制:活化的Ah R促進(jìn)Src磷酸化,旁路激活下游PI3K/Akt和MEK/Erk信號(hào)通路。Ah R本身不是激酶,但可以通過招募其它激酶提供旁路信號(hào),導(dǎo)致敏感細(xì)胞TKIs耐受。值得注意的是Ah R與Jak2/Src蛋白相互作用不依賴其經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄因子活性,Ah R作為adaptor介導(dǎo)Jak2和Src相互作用,形成的Jak2-Ah R-Src復(fù)合物繞過EGFR磷酸化Akt和Erk,故Jak2、Ah R和Src均可作為克服TKIs耐藥的治療靶點(diǎn)。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R734.2
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本文編號(hào)：2456981