【摘要】：Ⅰ人源化乳腺癌耐藥蛋白高表達(dá)BCRP-MDCKⅡ細(xì)胞模型的建立乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein, BCRP)的分子量約為72 kDa,屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族。BCRP除了在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)介導(dǎo)多藥耐藥,也廣泛存在于正常組織如肝臟、小腸、腎臟及某些特殊生理屏障如血腦屏障、胎盤屏障的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上。BCRP通過(guò)利用ATP水解釋放的能量,將細(xì)胞內(nèi)的有毒物質(zhì)或者藥物通過(guò)胃腸道、膽汁和尿液排出體外,發(fā)揮其抵抗外來(lái)毒性物質(zhì)侵襲的作用。由于BCRP的外排作用能夠影響藥物的生物利用度、肝腎排泄率和組織分布,因此誘導(dǎo)或抑制BCRP的表達(dá)增加了體內(nèi)藥物-藥物相互作用發(fā)生的潛在可能。這對(duì)于一些治療指數(shù)小的藥物如米托蒽醌、拓?fù)涮婵档扔绕渲匾�。�?duì)于治療窗狹窄的藥物而言,體內(nèi)藥物暴露量的微小波動(dòng)可能引發(fā)臨床療效和毒性作用的顯著變化,進(jìn)而導(dǎo)致不良反應(yīng)的發(fā)生。人源化BCRP高表達(dá)BCRP-MDCKⅡ細(xì)胞模型由于培養(yǎng)周期短,代與代之間均一性良好,常作為體外篩選BCRP底物和抑制劑的細(xì)胞模型,并可用于研究BCRP介導(dǎo)藥物-藥物相互作用(DDI)發(fā)生的可能性。本研究應(yīng)用慢病毒感染MDCKⅡ細(xì)胞的方法建立人源化BCRP高表達(dá)BCRP-MDCKⅡ細(xì)胞模型。結(jié)果表明：1.酶切實(shí)驗(yàn)和DNA測(cè)序結(jié)果表明,攜帶目的基因ABCG2表達(dá)質(zhì)粒pSIN4-EF2-ABCG2-IRES-Neo的菌種可在Soc培養(yǎng)基中正確擴(kuò)增和富集。2.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法介導(dǎo)pSIN4-EF2-ABCG2-IRES-Neo質(zhì)粒進(jìn)入病毒包裝細(xì)胞HEK-293T,經(jīng)G418篩選后,可得到含有目的基因BCRP的慢病毒。病毒滴度經(jīng)測(cè)定為5×104 pfu/mL。3.慢病毒感染MDCKⅡ細(xì)胞,經(jīng)G418篩選后,可得到人源化高表達(dá)BCRP-MDCKⅡ細(xì)胞模型。RT-PCR和western blot結(jié)果表明,BCRP-MDCKⅡ細(xì)胞株可穩(wěn)定高表達(dá)外源基因ABCG2。Hoechest 33342外排實(shí)驗(yàn)和米托蒽醌雙向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩個(gè)底物在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的外排率均較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞提高2倍以上,說(shuō)明轉(zhuǎn)染的BCRP功能良好,可作為體外篩選BCRP底物和抑制劑的細(xì)胞模型。綜上所述,本研究應(yīng)用慢病毒感染MDCKⅡ細(xì)胞的方法構(gòu)建了人源化BCRP高表達(dá)BCRP-MDCKⅡ細(xì)胞模型,轉(zhuǎn)染10代后仍可穩(wěn)定高表達(dá)目的蛋白BCRP,為體外篩選BCRP底物和抑制劑及研究化合物和BCRP相互作用提供了可靠、實(shí)用的細(xì)胞模型。Ⅱ H002臨床前藥代動(dòng)力學(xué)研究H002是一種新型鞘氨醇-1-磷酸受體1(Sphingosine 1-phosphate receptor subtype 1, S1PR1)激動(dòng)劑。與傳統(tǒng)免疫抑制劑(如糖皮質(zhì)激素、環(huán)孢素A、他克莫司等)的作用機(jī)制不同,H002在體內(nèi)可逆地生成其活性形式—磷酸化產(chǎn)物H002-P,通過(guò)與S1PR1結(jié)合使其發(fā)生內(nèi)陷,誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞“歸巢”,抑制淋巴細(xì)胞自外周淋巴結(jié)及次級(jí)淋巴器官的外流,從而發(fā)揮免疫調(diào)控作用。前期藥理研究表明,H002對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、實(shí)驗(yàn)性銀屑病等免疫性疾病動(dòng)物模型均有較好的藥效。此外,H002誘導(dǎo)的外周血淋巴細(xì)胞數(shù)降低可在停藥后短時(shí)間內(nèi)恢復(fù)至正常水平,對(duì)機(jī)體正常免疫功能的影響較小。與已上市的S1PR1受體調(diào)節(jié)劑FTY720相比,H002作用于S1PR3的EC50 S1PR1的150倍[1],顯著高于文獻(xiàn)報(bào)道的FTY720對(duì)兩個(gè)受體亞型的相對(duì)激活比值(3倍)[2],具有受體選擇性高,引起心動(dòng)過(guò)緩等不良反應(yīng)的可能性較小的特點(diǎn)。本研究根據(jù)臨床前藥代動(dòng)力學(xué)指導(dǎo)原則,建立了生物樣品中H002及其代謝產(chǎn)物的LC-MS/MS分析方法,該方法簡(jiǎn)便、可靠、靈敏度高、特異性強(qiáng),可滿足H002的臨床前藥代動(dòng)力學(xué)研究的需要。應(yīng)用已建立的LC-MS/MS方法研究了大鼠和Beagle犬口服和靜脈注射H002后的全血藥代動(dòng)力學(xué)、分布(大鼠)和排泄特征；鑒定了H002生物轉(zhuǎn)化的主要場(chǎng)所和參與代謝的主要藥酶類型；研究了H002與大鼠、犬、猴、人的血漿蛋白結(jié)合及其對(duì)CYP450s和UDPGT活性的影響,為揭示藥物在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律及種屬差異,闡明藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ),了解藥物在體內(nèi)代謝、排泄特點(diǎn)以及預(yù)測(cè)潛在的藥物相互作用提供試驗(yàn)依據(jù)。研究結(jié)果表明：1.生物樣品中H002及其代謝產(chǎn)物測(cè)定方法(LC-MS/MS)的建立大鼠全血基質(zhì)中,H002及其磷酸化產(chǎn)物H002-P、羥化產(chǎn)物H002-M分別在0.2-100 ng/mL、0.25-100 ng/mL和0.2-100 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,未見(jiàn)明顯基質(zhì)和雜質(zhì)干擾。H002、H002-P和H002-M質(zhì)控樣品(濃度分別為0.5、 25、80 ng/mL,1.5、25、80 ng/mL,0.5、25、80 ng/mL,)的日內(nèi)和日間精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差均小于11.76%,準(zhǔn)確度為±9.84%。低、中、高質(zhì)控樣品回收率為92.02-108.18%,基質(zhì)效應(yīng)為95.01-104.08%。質(zhì)控樣品在冰上放置6 h、處理后樣品室溫放置24 h、進(jìn)樣艙放置48 h、長(zhǎng)期放置(-80℃放置7天、30天、3個(gè)月)和反復(fù)凍融3次等條件下均穩(wěn)定。H002、H002-P和H002-M高濃度樣品用大鼠空白全血稀釋2、5、10、20倍后均不影響測(cè)定的準(zhǔn)確性。Beagle犬全血基質(zhì)中,H002及H002-P、H002-M分別在0.5-500 ng/mL、 0.25-100 ng/mL和0.5-100 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,全血中未見(jiàn)明顯基質(zhì)和雜質(zhì)干擾。H002、H002-P和H002-M質(zhì)控樣品(1.5、75、400 ng/mL,0.6、 25、80 ng/mL,1.5、25、80 ng/mL,)的日內(nèi)和日間精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差均小于9.30%,低濃度的準(zhǔn)確度在±18.00%范圍內(nèi),中、高濃度的準(zhǔn)確度在±14.80%范圍內(nèi)。低、中、高質(zhì)控樣品的回收率為106.78-112.49%,基質(zhì)效應(yīng)為97.45-104.42%。質(zhì)控樣品在冰上放置6 h、處理后樣品室溫放置24 h、進(jìn)樣艙放置48 h、長(zhǎng)期放置(-80℃放置7天、30天、6個(gè)月)和反復(fù)凍融3次等條件下均穩(wěn)定。H002、H002-P和H002-M高濃度樣品用犬空白全血稀釋5、10、20倍后均不影響測(cè)定的準(zhǔn)確性。2.H002在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究(1)大鼠口服H002后的全血藥代動(dòng)力學(xué)雌雄大鼠口服H002(1、3、10、30 mg/kg)后5 min血中可檢測(cè)到H002、H002-P和H002-M,給藥后72-144h各組動(dòng)物血藥濃度低于或接近檢測(cè)限。雄鼠口服H002 1、3、10、30 mg/kg后全血中原型藥的Tmax分別為5.6、1.2、4.0、2.0h,Cmax分別為5.87、22.20、55.30、267.60 ng/mL, AUC(0-t)分別為93.16、125.79、630.27和3782.58 ng/mL×h, t1/2分別為9.12、13.42、10.41和18.37 h,MRT(0-t)分別為12.05、10.42、11.37和14.38 h；H002-P的Tmax分別為7.2、6.8、6.0、5.6 h,Cmax分別為24.02、45.76、161.22、567.20 ng/mL, AUC(0-t)分別為384.09、464.82、2348.96和10802.89 ng/mL×h, t1/2分別為8.14、12.43、12.65和16.00 h,MRT(0-t)分別為14.75、12.34、13.72和16.33 h；H002-M的Tmax分別為7.2、4.8、6.8、6.0h,Cmax分別為5.40、13.06、33.50、114.46 ng/mL,AUC(0-t)分別為82.35、127.40、427.18和2213.58 ng/mL×h, t1/2分別為8.74、5.95、7.07和16.62 h,MRT(0-t)分別為11.80、9.94、11.26和15.98 h。雌鼠口服H0021、3、10、30 mg/kg后全血中原型藥的Tmax分別為4.0、2.5、4.8、1.3 h,Cmax分別為7.74、21.38、69.50、435.4 ng/mL, AUC(0-t)分別為104.63、192.08、987.84和5526.58 ng/mL×h, t1/2分別為5.04、16.21、11.57和15.02 h,MRT(0-t)分別為10.72、11.42、11.39和20.58 h；H002-P的Tmax分別為8.8、6.4、6.4、4.0 h,Cmax分別為28.68、56.08、235.00,770.60 ng/mL, AUC(0-t)分別為461.73、705.88、3723.55和16612.94 ng/mL×h, t1/2分別為9.74、12.31、13.42和17.13 h,MRT(0-t)分別為13.26、13.19、13.53和22.43 h：H002-M的Tmax分別為7.2、5.2、5.6、10.4 h,Cmax分別為4.62、12.28、31.82、79.60 ng/mL, AUC(0-t)分別為65.90、130.42、472.68和2059.02 ng/mL×h, t1/2分別為8.75、7.22、7.91和15.43 h,MRT(0-t)分別為11.46、10.73、11.40和24.26 h。雌雄大鼠口服H002后,H002、H002-P和H002-M的Cmax和AUC(0-t)隨劑量增加而遞增,在1-30 mg/kg劑量范圍內(nèi)原型藥、H002-P和H002-M在體內(nèi)基本呈線性動(dòng)力學(xué)過(guò)程,高劑量組t1/2和MRT(0-t)隨劑量增加略有延長(zhǎng)。各劑量組H002-P的Cmax和AUC(0-t)均大于原型藥和H002-M。雌鼠口服H002后原型藥和H002-P的AUC(0-t)略高于雄鼠,H002-M無(wú)明顯性別差異。(2)大鼠靜脈注射H002后的全血藥代動(dòng)力學(xué)雌雄大鼠靜脈注射H002后2 min血中可檢測(cè)到原型藥及代謝物H002-P和H002-M,給藥后48h各組動(dòng)物血藥濃度低于或接近檢測(cè)限。雌、雄大鼠給藥后2min原型藥的平均血藥濃度分別為348.6和304 ng/mL, AUC(0-t)分別為187.85和141.3 ng/mL×h,t1/2分別為7.73和7.43 h,MRT(0-t)分別為6.71和5.83 h；代謝物H002-P的Tmax分別為0.93和0.41 h,Cmax分別為41.72和47.12 ng/mL,AUC(0-t)分別為399.49和299.88 ng/mL×h, t1/2分別為7.47和6.95h,MRT(0-t)分別為9.56和8.37 h；代謝物H002-M的Tmax分別為0.69和0.10h, Cmax分別為6.71和7.69 ng/mL, AUC(0-t)分別為57.29和43.56 ng/mL×h, t1/2分別為9.7和10.33 h,MRT(0-t)分別為11.54和11.37h。雌、雄大鼠口服H002(3 mg/kg)后原型藥的生物利用度分別為9.62%和8.90%(H002-P相當(dāng)于等劑量靜脈給藥的17.91%和15.66%)。(3)大鼠口服11002后在體內(nèi)主要組織的分布大鼠口服H002(1 mg/kg)后原型藥和代謝物在體內(nèi)分布廣泛。雄鼠給藥后0.5 h組織和器官中原型藥濃度排序?yàn)椋何感∧c淋巴結(jié)腎上腺肺肝臟腎骨髓脂肪脾肌肉附睪心臟胸腺睪丸全血,腦中藥物濃度低于最低定量限。雌鼠給藥后0.5 h組織和器官中原型藥濃度排序?yàn)椋毫馨徒Y(jié)胃小腸腎上腺肺子宮心臟卵巢肝臟腎骨髓脂肪脾肌肉胸腺腦全血。雌雄給藥后4 h、18 h的分布趨勢(shì)與0.5 h相似。H002-P和H002-M在各組織中的分布趨勢(shì)和原型藥相似。大鼠口服H002后在胃腸道及血流量豐富組織的分布較多。多數(shù)組織中的藥物濃度高于同時(shí)間點(diǎn)血藥濃度。雌雄大鼠的組織分布趨勢(shì)基本相似,無(wú)明顯性別差異。(4)大鼠口服H002后自糞、尿、膽汁中的排泄雌雄大鼠口服H002后在糞、尿、膽汁中均可檢測(cè)到原型藥、H002-P、H002-M和羥化產(chǎn)物的硫酸結(jié)合物(H002-OSO3)。雄雌大鼠口服H002(1 mg/kg)后膽汁中原型藥、H002-M、H002-OSO3(校正定量)、H002-P的累積排泄量分別為給藥量的0.007%、0.375%、4.826%、0.008%和0.011%、0.642%、5.796%、0.060%。雄雌大鼠給藥后72 h膽汁中原型藥和代謝物的累積排泄量分別約為給藥量的5.216%和6.509%。雄雌大鼠口服H002 (1 mg/kg)后糞便中原型藥、H002-M、H002-OSO3(校正定量)、H002-P的累積排泄量分別為給藥量的2.353%、15.233%、33.114%、0.047%和1.627%、12.825%、20.569%、0.052%,雄雌大鼠給藥后6 d糞便中原型藥和代謝物的累積排泄量分別約為給藥量的50.747%和35.073%。雄雌大鼠口服H002(1 mg/kg)后尿液中原型藥、H002-M、H002-OSO3(校正定量)、H002-P的累積排泄量分別為給藥量的0.049%、5.576%、0.630%、0.010%和0.012%、7.197%、0.666%、0.005%,雄雌大鼠給藥后6 d尿液中原型藥和代謝物的累積排泄量分別約為給藥量的6.265%和7.880%。雄雌大鼠口服H002(1 mg/kg)后原型藥和代謝物糞、尿總排泄量分別為給藥量的57.01%和42.95%,主要經(jīng)糞便途徑。(5)H002與大鼠、犬、猴和人的血漿蛋白的結(jié)合H002(30、300和1500 ng/mL)與大鼠、犬、猴和人的血漿蛋白結(jié)合率為98.13-99.17%,提示H002與血漿蛋白高度結(jié)合,各種屬間無(wú)明顯差異,也未見(jiàn)明顯濃度依賴性。3.H002在Beagle犬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究(1) Beagle犬口服H002后的全血藥代動(dòng)力學(xué)Beagle犬口服H002 0.3、1.8、10 mg/kg后5-30 min血中可檢測(cè)到原型藥、H002-P和H002-M(0.3mg/kg劑量組多數(shù)時(shí)間點(diǎn)H002-M的濃度均低于最低定量限),血藥濃度呈多峰現(xiàn)象,給藥后384-1248 h各組動(dòng)物血藥濃度低于或接近檢測(cè)限。雌犬口服0.3、1.8、10 mg/kg H002后全血中原型藥的Tmax分別為19.75、6.50、5.50 h,Cmax分別為28.45、276.25、1562.5 ng/mL, AUC(0-t)分別為2951.13、28030.93和291344.91 ng/mL×h, t1/2為82.95、97.63和160.88 h,MRT(0-t)分別為111.24、119.75和233.38 h；H002-P的Tmax分別為19.50、21.00、34.50 h,Cmax分別為2.48、11.67、90.88 ng/mL, AUC(0-t)分別為401.53、1460.88和19964.51 ng/mL×h,t1/2分別為136.23、89.91和143.52 h,MRT(0-t)分別為146.70、112.51和237.31 h；中高劑量組H002-M的Tmax分別為16.00和19.00 h,Cmax分別為5.74和44.35 ng/mL, AUC(0-t)分別為471.12和4877.23 ng/mL×h, t1/2分別為148.63和125.44 h,MRT(0-t)分別為81.55和158.08 h。雄犬口服0.3、1.8、10 mg/kg H002后全血中原型藥的Tmax分別為11.00、4.25、5.00 h,Cmax分別為27.38、283.5、1685.00 ng/mL, AUC(0-t)分別為1347.83、22169.09和108385.97 ng/mL×h,t1/2分別為46.71、89.83和168.56 h,MRT(0-t)分別為72.80、98.46和170.17 h；H002-P的Tmax分別為15.00、18.00、19.50 h,Cmax分別為1.72、10.09、93.20 ng/mL, AUC(0-t)分別為202.87、1092.17和10254.62 ng/mL×h, t1/2分別為106.53、68.50和111.27 h,MRT(0-t)分別為91.57、90.62和142.82 h；中高劑量組H002-M的Tmax分別為18.00和20.00 h,Cmax分別為9.74和55.48 ng/mL AUC(0-t)分別為518.04和4799.64 ng/mL×h, t1/2分別為82.66和93.08 h,MRT(0-t)分別為120.57和117.51 h。雌雄Beagle犬口服H002后,原型藥和代謝物的Cmax和AUC(0-t)隨給藥劑量增加而遞增,在0.3～10 mg/kg劑量范圍內(nèi)原型藥及代謝物在體內(nèi)基本呈線性動(dòng)力學(xué)過(guò)程,高劑量組t1/2和MRT0-t¨隨劑量增加略有延長(zhǎng)。各劑量組原型藥的Cmax和AUC(0-t)均高于H002-P和H002-M。血中原型藥和H002-P的Cmax未見(jiàn)明顯性別差異,但雌犬的AUC(0-t)略高于雄犬,t1/2和MRT(0-t)也有所延長(zhǎng),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；H002-M的的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)未見(jiàn)明顯性別差異。(2) Beagle犬靜脈注射H002后的全血藥代動(dòng)力學(xué)雌雄Beagle犬靜脈注射H002 (0.1 mg/kg)后2 min血中可檢測(cè)到原型藥和代謝物H002-P,多數(shù)時(shí)間點(diǎn)血樣中代謝物H002-M的含量低于最低定量限(0.5 ng/ml)。原型藥和H002-P的血藥濃度于給藥后22 d和16 d低于或接近檢測(cè)限。雌、雄犬給藥2 min后全血中原型藥平均濃度分別為152.50和155.00 ng/mL, AUC(0-t)分別為3352.71和2238.90 ng/mL×h, t1/2分別為111.91和62.92 h,MRT(0-t)分別為85.04和63.29 h；代謝物H002-P的Cmax分別為1.13和1.23 ng/mL,AUC(0-t)分別為159.02和103.02 ng/mL×h,t1/2分別為102.99和73.45 h,MRT(0-t)分別為110.67和61.80 h。雌雄Beagle犬口服H002 1.8 mg/kg后原型藥的生物利用度分別為46.4%和55.0%(H002-P分別相當(dāng)于等劑量靜脈給藥的51.05%和58.90%)。(3) Beagle犬多次口服H002后的全血藥代動(dòng)力學(xué)Beagle犬連續(xù)口服H002 (1.8 mg/kg)12天后血藥濃度達(dá)到穩(wěn)態(tài),末次給藥后雌雄犬血中原型藥、H002-P和H002-M的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)未見(jiàn)明顯性別差異。與單次給藥相比,末次給藥后(24 h)原型藥和代謝物的Cmax和AUC(0-t)均明顯增加。雌犬原型藥、H002-P、H002-M的Cmax增加倍數(shù)分別為3.06、3.14和4.24倍,AUC(0-t)增加倍數(shù)分別為3.31、3.78和4.93倍；雄犬原型藥、H002-P、H002-M的Cmax增加倍數(shù)分別為2.91、3.23和3.42倍,AUC(0-t)增加倍數(shù)分別為3.03、3.30和3.68倍,提示Beagele犬多次口服H002后原型藥和代謝物在體內(nèi)有蓄積傾向。(4) Beagle犬口服H002后自糞、尿中的排泄Beagle犬口服H002后糞、尿中均可檢測(cè)到原型藥、H002-P、H002-M及H002-OS03。雌雄Beagle犬口服H002(1.8mg/kg)后原型藥、H002-M、H002-OSO3(校正定量)和H002-P經(jīng)糞的累積排泄量分別為給藥量的15.622%、5.945%、74.912%、0.269%和16.797%、5.733%、73.872%、0.250%,雌雄Beagle犬糞中原型藥和代謝物的累積排泄量分別約為給藥量的96.748%和96.652%。雌雄Beagle犬口服H002 (1.8 mg/kg)后原型藥、H002-M、H002-OSO3(校正定量)和H002-P經(jīng)尿的累積排泄量分別為給藥量的0.549%、2.494%、1.499%、0.005%和0.476%、2.671%、2.140%、0.005%,原型藥和代謝物在雌雄Beagle犬尿中的累積排泄量分別約為給藥量的4.547%和5.292%。雌雄Beagle犬口服H002 (1.8 mg/kg)后30天內(nèi)原型藥和代謝物糞、尿總排泄量分別為給藥量的101.30%和101.94%,主要經(jīng)糞排泄。4.H002的生物轉(zhuǎn)化研究大鼠、Beagle犬口服H002后在血、糞、尿、膽汁中可檢測(cè)到多個(gè)代謝產(chǎn)物,包括磷酸化產(chǎn)物(H002-P)、羥化產(chǎn)物(H002-M)、羥化產(chǎn)物的硫酸結(jié)合物(H002-OSO3)。H002與大鼠/人/犬/猴肝微粒體體外溫孵后也可檢測(cè)到代謝物H002-P和H002-M,體內(nèi)外代謝產(chǎn)物具有一定的相關(guān)性,而H002-OSO3主要在體內(nèi)生成。體外代謝穩(wěn)定性研究結(jié)果表明,H002 (10μM)與人工胃液、人工腸液、腸道菌群及大鼠血漿溫孵6 h后未見(jiàn)明顯減少。與大鼠、犬、猴、人全血溫孵6 h后H002-P的生成量隨溫孵時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加,提示全血可能是H002-P生成的主要場(chǎng)所。H002與大鼠不同組織勻漿溫孵后,H002-P的生成量依次排序?yàn)檠闻K脾臟腦胃淋巴結(jié)心臟腎肺小腸胸腺,H002-M生成量的排序?yàn)楦闻K小腸肺脾淋巴結(jié)腎腦胸腺心臟胃,進(jìn)一步提示H002-P生成的主要場(chǎng)所為全血,H002-M生成的主要場(chǎng)所為肝臟和小腸。H002與大鼠、犬、猴、人紅細(xì)胞溫孵結(jié)果表明,紅細(xì)胞是H002-P生成的重要場(chǎng)所,生成速率依次為大鼠猴人犬,SPHK1的選擇性抑制劑CB5468139、SPHK1和SPHK2的雙重抑制劑DMS、SPHK2的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑FTY720可不同程度地抑制H002-P的生成,提示SPHK1及SPHK2均可能參與H002-P在紅細(xì)胞中的生成。體外肝微粒體溫孵實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,H002在大鼠、犬和人肝微粒中的氧化代謝物除H002-M外,還可檢測(cè)到另一個(gè)羥化產(chǎn)物H002-M1,而猴肝微粒體中H002的氧化代謝物主要為H002-M1。應(yīng)用CYP450同工酶的選擇性抑制劑、抗體和14個(gè)人源化重組酶的研究結(jié)果表明,CYP1A1、CYP2J2、CYP3A4、CYP4F2主要參與H002-M的生成,CYP1A2、CYP2D6、CYP4F12等也有少量參與。參與H002-M1生成的同工酶主要為CYP2J2、CYP4F2、CYP4F3B,以上結(jié)果提示H002的氧化代謝是多酶參與的轉(zhuǎn)化過(guò)程。5.H002及其代謝產(chǎn)物對(duì)藥物代謝酶的抑制/誘導(dǎo)作用H002體外(1-10 μM)對(duì)大鼠/人/犬/猴肝微粒體中的CYP1A2、CYP2C19、 CYP4F2、CYP2C9、CYP2D6、CYP2J2、CYP2E1的抑制作用為20.16%-40.33%,H002-P (1-10 μM)對(duì)以上4個(gè)種屬肝微粒體CYP1A2、CYP2C19、CYP2E1、 CYP2J2、CYP2C9、CYP4F2的抑制作用為26.10%-43.17%,H002-M對(duì)以上4個(gè)種屬肝微粒體CYP1A2、CYP2C19、CYP2E1、CYP2J2、CYP4F2、CYP2C9的抑制作用為21.07%-56.69%,上述抑制作用明顯弱于陽(yáng)性抑制劑,且濃度高于本研究中大鼠、犬所用最高劑量的Cmax。H002對(duì)肝微粒體CYP2D6、CYP3A4無(wú)明顯影響。雄鼠多次口服H002 (3 mg/kg/d×7d)后肝微粒體CYP2E1、CYP2J3/4活性輕度降低(21.1%-33.3%)；雌鼠CYP1A2、CYP2C11、CYP2C6酶活性輕度升高(20.1%-44.1%),CYP4F1略有降低(21.2%)。H002對(duì)雄鼠的GST有輕度誘導(dǎo)作用,對(duì)UDPGT有輕度抑制作用,但對(duì)雌鼠GST和UDPGT均無(wú)明顯影響。6.H002在Caco-2和MDR1-MDCKII細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)H002在Caco-2和MDR1-MDCKII細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)具有明顯的方向性,當(dāng)加入P-糖蛋白抑制劑PSC833后方向性消失,提示H002可能是P-gp的底物。MDR1-MDCKII細(xì)胞中H002對(duì)P-gp介導(dǎo)的地高辛轉(zhuǎn)運(yùn)活性具有一定的抑制作用,IC50為0.29 μM。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.9
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本文編號(hào)：2456828