【摘要】：目的:通過(guò)抑制細(xì)胞的凋亡或壞死性凋亡途徑,檢測(cè)人肝癌細(xì)胞SK-Hep1和線粒體缺失的肝癌細(xì)胞P0SK-Hep1中Rac1及IRAK1蛋白表達(dá)的變化,從而探討Rac1及IRAK1通過(guò)何種細(xì)胞死亡方式影響細(xì)胞的增殖與凋亡以及細(xì)胞線粒體缺失后對(duì)此的影響。方法:1、培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株SK-Hep1并建立線粒體DNA缺失的人肝癌細(xì)胞株P(guān)0SK-Hep1。2、分別用不同濃度特異性壞死性凋亡抑制劑Nec-1和廣譜Caspase抑制劑z-VAD-FMK處理肝癌細(xì)胞SK-Hep1,使用MTS方法檢測(cè)該藥物對(duì)細(xì)胞的毒性作用,并選出合適的處理濃度。3、肝癌細(xì)胞SK-Hep1轉(zhuǎn)染熒光標(biāo)記的siRNA,通過(guò)熒光顯微鏡觀察其轉(zhuǎn)染效果,為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)選出合適的轉(zhuǎn)染條件,保證干擾實(shí)驗(yàn)達(dá)到較好的干擾效果。4、用Nec-1、z-VAD-FMK和Nec-1聯(lián)合z-VAD-FMK分別處理肝癌細(xì)胞SK-Hep1,三個(gè)不同處理組再分別轉(zhuǎn)染三種與凋亡或壞死性凋亡相關(guān)蛋白的小干擾RNA,轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞后再提取細(xì)胞的總蛋白,最后運(yùn)用western blot法檢測(cè)干擾的目的蛋白和Rac1及IRAK1的蛋白表達(dá)變化。5、用Nec-1、z-VAD-FMK和Nec-1聯(lián)合z-VAD-FMK分別處理線粒體DNA缺失的肝癌細(xì)胞P0SK-Hep1,三個(gè)不同處理組再分別轉(zhuǎn)染三種與凋亡或壞死性凋亡相關(guān)蛋白的小干擾RNA,轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞后再提取細(xì)胞的總蛋白,最后運(yùn)用western blot法檢測(cè)干擾的目的蛋白和Rac1及IRAK1的蛋白表達(dá)變化。結(jié)果:1、用不同濃度的特異性壞死性凋亡抑制劑Nec-1處理肝癌細(xì)胞SK-Hep1后,與DMS0組相比,30μM組的細(xì)胞存活率有明顯差異(P0.05),而60μM組的細(xì)胞存活率高于90 μM組。2、用不同濃度的廣譜Caspase抑制劑z-VAD-FMK處理肝癌細(xì)胞SK-Hep1后,與DMS0組相比,10 μM組的細(xì)胞存活率有明顯差異(P0.05),而20 μM組的細(xì)胞存活率高于40 μM組。3、使用FAM-siRNA轉(zhuǎn)染SK-Hep1肝癌細(xì)胞,在熒光顯微鏡下觀察到轉(zhuǎn)染后的肝癌細(xì)胞在藍(lán)光的激發(fā)下可以看見有多數(shù)表達(dá)綠色熒光。4、在干擾RIP1的肝癌細(xì)胞SK和P0SK中,與空白組及陰性對(duì)照組相比,經(jīng)過(guò)Nec-1、z-VAD-FMK及Nec-1聯(lián)合z-VAD-FMK干預(yù)后三組細(xì)胞的Rac1蛋白表達(dá)量明顯降低(P0.05);SK細(xì)胞中與空白組及陰性對(duì)照組相比,只有經(jīng)過(guò)Nec-1聯(lián)合z-VAD-FMK干預(yù)后細(xì)胞的IRAK1蛋白表達(dá)量明顯上升(P0.05),P0SK細(xì)胞中三組實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的IRAK1蛋白表達(dá)量均未見明顯差異(P0.05)。5、在干擾FADD的肝癌細(xì)胞SK和P0SK中,與空白組、陰性對(duì)照組及經(jīng)Nec-1組相比,經(jīng)過(guò)z-VAD-FMK及Nec-1聯(lián)合z-VAD-FMK干預(yù)后細(xì)胞的Rac1蛋白表達(dá)量明顯上升(P0.05)。SK細(xì)胞中與空白組及陰性對(duì)照組相比,只有經(jīng)過(guò)Nec-1聯(lián)合z-VAD-FMK干預(yù)后細(xì)胞的IRAK1蛋白表達(dá)量明顯降低(P0.05),P0SK細(xì)胞中三組實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的IRAK1蛋白表達(dá)量均未見明顯差異(P0.05)。6、在干擾TRAF6的肝癌細(xì)胞SK和P0SK中,與空白組、陰性對(duì)照組及經(jīng)Nec-1組相比,經(jīng)過(guò)z-VAD-FMK及Nec-1聯(lián)合z-VAD-FMK干預(yù)后兩組細(xì)胞的Rac1蛋白表達(dá)量明顯降低(P0.05),而三組實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的IRAK1蛋白表達(dá)量均未見明顯差異(P0.05)。結(jié)論:1、Rac1及IRAK1在人肝癌細(xì)胞株SK-Hep1和線粒體DNA缺失的人肝癌細(xì)胞株P(guān)0SK-Hep1中均有表達(dá);2、Rac1及IRAK1促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡;3、Rac1主要是通過(guò)細(xì)胞凋亡的途徑影響肝癌細(xì)胞的增殖與凋亡,與壞死性凋亡無(wú)關(guān),而IRAK1主要影響細(xì)胞的凋亡和壞死性凋亡兩種途徑;4、在肝癌細(xì)胞中線粒體DNA的缺失對(duì)Rac1引起的細(xì)胞凋亡無(wú)明顯作用,而對(duì)IRAK1引起的細(xì)胞凋亡或壞死性凋亡有影響。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2455729