【摘要】：根據(jù)美國癌癥協(xié)會(huì)的最新數(shù)據(jù)顯示,無論是發(fā)達(dá)國家還是發(fā)展中國家,腫瘤已然成為一個(gè)世界性的健康問題。而且即使是在世界范圍內(nèi),肝癌的發(fā)病率仍然在所有腫瘤疾病中名列前十。中國作為一個(gè)乙肝大國,有著較高的肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)美國癌癥協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì),截至2015年,肝癌在我國所有腫瘤相關(guān)疾病中的發(fā)病率名列前五,且在男性患者中排名第三。而作為惡性程度較高的肝癌,往往發(fā)現(xiàn)較遲,且限于各種原因,患者不能得到較好較及時(shí)的手術(shù)治療。由此,發(fā)現(xiàn)更多肝癌治療手段的任務(wù)迫在眉睫。磷酸二酯酶(PDEs)是一組有著11個(gè)基因亞型,能夠特異性水解環(huán)磷酸腺苷(cAMP)和環(huán)磷酸鳥苷(cGMP),從而影響cAMP和cGMP所參與介導(dǎo)的cAMP/PKA通路和cGMP/PKC通路,最終調(diào)控有關(guān)激素以及信號(hào)通路的基因家族。已有的研究結(jié)果表明,PDE7A在肝臟細(xì)胞中有明顯表達(dá),且能夠相對(duì)特異性的參與水解cAMP,通過改變cAMP在細(xì)胞內(nèi)的水平,進(jìn)一步間接的調(diào)控細(xì)胞的增殖、生長、凋亡等生物學(xué)行為。這也就意味著在肝細(xì)胞肝癌中對(duì)PDE7A的深入研究在肝癌的診療進(jìn)展上有著明顯的促進(jìn)作用。第一部分磷酸二酯酶7A(PDE7A)具有促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和遷移的能力目的：磷酸二酯酶7A (PDE7A)是磷酸二酯酶家族(PDEs)中的一員,它在肝臟、頭顱等組織器官中均有著一定量的表達(dá)與分布。和大部分的PDEs成員一樣,PDE7A能夠特異性的水解cAMP,從而影響cAMP所參與調(diào)節(jié)的下游通路的表達(dá)。異常的細(xì)胞周期,無限的增殖,以及突出的遷移侵襲能力是腫瘤所共有的突出特點(diǎn),根據(jù)已有的研究結(jié)果顯示,PDE7A很有可能表現(xiàn)出類似腫瘤基因的作用,并且在惡性腫瘤的過度增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等各方面發(fā)揮出不同的作用。本實(shí)驗(yàn)希望能夠進(jìn)一步明確PDE7A在肝癌細(xì)胞中對(duì)增殖、遷移等方面的具體影響。方法：首先通過浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院肝癌患者的標(biāo)本資料庫提取90名肝癌患者的癌組織和癌旁組織,對(duì)其進(jìn)行免疫組化檢測(cè)PDE7A的含量；對(duì)90名患者的術(shù)后生存期做長達(dá)五年的隨訪并做PDE7A相關(guān)的生存曲線分析。利用Western blotting技術(shù)對(duì)目前常用的肝癌細(xì)胞系,如HepG2、SK-Hep-1、HCC-LM3、 SMMC-7721和Huh-7等檢測(cè)PDE7A的表達(dá)量水平,確定實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞系。通過小干擾RNA(siRNA)技術(shù)抑制PDE7A在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)量水平,構(gòu)建PDE7A正常表達(dá)組和PDE7A低表達(dá)組模型。利用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)PDE7A正常表達(dá)組和PDE7A低表達(dá)組中細(xì)胞周期分布的變化；利用Western blotting技術(shù)分別檢測(cè)PDE7A正常表達(dá)組和PDE7A低表達(dá)組中有關(guān)的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的表達(dá)量水平。通過劃痕實(shí)驗(yàn)以及Transwell實(shí)驗(yàn)比較PDE7A正常表達(dá)組和PDE7A低表達(dá)組中細(xì)胞侵襲遷移能力的差異。EdU技術(shù)以及CCK8技術(shù)檢測(cè)比較PDE7A正常表達(dá)組和PDE7A低表達(dá)組細(xì)胞增殖能力的差異。結(jié)果：在我們所統(tǒng)計(jì)的90對(duì)肝癌組織和癌旁組織中,免疫組化的結(jié)果顯示約有53對(duì)組織中肝癌組織內(nèi)PDE7A的表達(dá)量高于癌旁組織。對(duì)90名患者手術(shù)后的生存分析結(jié)果顯示PDE7A高表達(dá)的患者五年存活率(27.9±6.2)明顯小于PDE7A低表達(dá)組的患者(55.4±8.9)。在常見的肝癌細(xì)胞系中,我們發(fā)現(xiàn)HCC-LM3細(xì)胞中PDE7A的表達(dá)量相對(duì)較高。通過siRNA技術(shù),我們對(duì)HCC-LM3細(xì)胞構(gòu)建了PDE7A正常表達(dá)組和PDE7A低表達(dá)組。Western blotting結(jié)果顯示PDE7A低表達(dá)組中周期相關(guān)蛋白的表達(dá)量較PDE7A正常表達(dá)組有明顯的下降。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示PDE7A低表達(dá)組中細(xì)胞周期大量阻滯在G2期。劃痕實(shí)驗(yàn)以及Transwell結(jié)果提示PDE7A低表達(dá)組中細(xì)胞侵襲遷移能力受到了明顯的抑制。EdU技術(shù)和CCK8檢測(cè)結(jié)果均提示PDE7A低表達(dá)組中細(xì)胞增殖能力較PDE7A正常表達(dá)組明顯下降。結(jié)論：肝癌組織中PDE7A的表達(dá)量水平相對(duì)癌旁組織要高；腫瘤組織中PDE7A表達(dá)水平低的患者5年生存率相對(duì)要高；PDE7A低表達(dá)的HCC-LM3細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)量水平也相對(duì)較低；PDE7A低表達(dá)的HCC-LM3細(xì)胞周期相對(duì)較多的阻滯在G2期；PDE7A低表達(dá)的HCC-LM3細(xì)胞侵襲遷移的能力相對(duì)受到明顯的抑制；PDE7A低表達(dá)的HCC-LM3細(xì)胞的增殖能力受到明顯的下調(diào)。第二部分磷酸二酯酶7A (PDE7A)促進(jìn)體內(nèi)外肝癌細(xì)胞的Warburg效應(yīng)抑制其凋亡目的：比較在體內(nèi)環(huán)境以及體外環(huán)境中,PDE7A表達(dá)量水平的高低對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長、腫瘤細(xì)胞的凋亡,以及對(duì)腫瘤特征性的Warburg效應(yīng)的影響。方法：利用第一部分中建立的PDE7A正常表達(dá)組和PDE7A低表達(dá)組,我們通過流式細(xì)胞術(shù)比較PDE7A正常表達(dá)組和PDE7A低表達(dá)組中細(xì)胞的凋亡水平的差異。利用Western blotting技術(shù)比較PDE7A正常表達(dá)組和PDE7A低表達(dá)組中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平變化。通過檢測(cè)比較PDE7A正常表達(dá)組和PDE7A低表達(dá)組中乳酸含量的差異,比較體外環(huán)境中Warburg效應(yīng)的差異。利用裸鼠皮下成瘤技術(shù),構(gòu)建PDE7A正常表達(dá)和PDE7A低表達(dá)的體內(nèi)模型,通過比較體內(nèi)模型中PDE7A正常表達(dá)組和PDE7A低表達(dá)組腫瘤生長的大小、質(zhì)量,比較PDE7A在體內(nèi)對(duì)腫瘤細(xì)胞生長的影響。通過免疫組化技術(shù)比較體內(nèi)模型中PDE7A正常表達(dá)組和PDE7A低表達(dá)組形成的腫瘤中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)量水平差異。通過免疫組化技術(shù)比較體內(nèi)模型中PDE7A正常表達(dá)組和PDE7A低表達(dá)組形成的腫瘤中Warburg效應(yīng)強(qiáng)度的差異。結(jié)果：根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果,體外實(shí)驗(yàn)中PDE7A低表達(dá)組中,細(xì)胞的凋亡水平明顯增高；根據(jù)Western blotting的結(jié)果,體外實(shí)驗(yàn)中PDE7A低表達(dá)組中,細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白表達(dá)水平明顯增高；根據(jù)乳酸產(chǎn)量的測(cè)定結(jié)果,體外實(shí)驗(yàn)中PDE7A低表達(dá)組中,細(xì)胞Warburg效應(yīng)受到明顯的抑制。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的模型中,PDE7A低表達(dá)組的腫瘤細(xì)胞生長速度明顯受限；PDE7A低表達(dá)組的PARP表達(dá)量明顯增加；PDE7A低表達(dá)組中的Warburg效應(yīng)明顯減弱。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)證明了在體外模型中PDE7A表達(dá)量的降低可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)量水平升高；可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的早期凋亡；可以明顯的抑制腫瘤的Warburg效應(yīng)。在體內(nèi)模型中,同樣的PDE7A低表達(dá)組可以明顯的抑制腫瘤的生長；能夠促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)；能夠抑制Warburg效應(yīng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：2455705