【摘要】：根據(jù)美國癌癥協(xié)會的最新數(shù)據(jù)顯示,無論是發(fā)達國家還是發(fā)展中國家,腫瘤已然成為一個世界性的健康問題。而且即使是在世界范圍內(nèi),肝癌的發(fā)病率仍然在所有腫瘤疾病中名列前十。中國作為一個乙肝大國,有著較高的肝癌發(fā)病風(fēng)險。據(jù)美國癌癥協(xié)會統(tǒng)計,截至2015年,肝癌在我國所有腫瘤相關(guān)疾病中的發(fā)病率名列前五,且在男性患者中排名第三。而作為惡性程度較高的肝癌,往往發(fā)現(xiàn)較遲,且限于各種原因,患者不能得到較好較及時的手術(shù)治療。由此,發(fā)現(xiàn)更多肝癌治療手段的任務(wù)迫在眉睫。磷酸二酯酶(PDEs)是一組有著11個基因亞型,能夠特異性水解環(huán)磷酸腺苷(cAMP)和環(huán)磷酸鳥苷(cGMP),從而影響cAMP和cGMP所參與介導(dǎo)的cAMP/PKA通路和cGMP/PKC通路,最終調(diào)控有關(guān)激素以及信號通路的基因家族。已有的研究結(jié)果表明,PDE7A在肝臟細胞中有明顯表達,且能夠相對特異性的參與水解cAMP,通過改變cAMP在細胞內(nèi)的水平,進一步間接的調(diào)控細胞的增殖、生長、凋亡等生物學(xué)行為。這也就意味著在肝細胞肝癌中對PDE7A的深入研究在肝癌的診療進展上有著明顯的促進作用。第一部分磷酸二酯酶7A(PDE7A)具有促進肝癌細胞增殖和遷移的能力目的：磷酸二酯酶7A (PDE7A)是磷酸二酯酶家族(PDEs)中的一員,它在肝臟、頭顱等組織器官中均有著一定量的表達與分布。和大部分的PDEs成員一樣,PDE7A能夠特異性的水解cAMP,從而影響cAMP所參與調(diào)節(jié)的下游通路的表達。異常的細胞周期,無限的增殖,以及突出的遷移侵襲能力是腫瘤所共有的突出特點,根據(jù)已有的研究結(jié)果顯示,PDE7A很有可能表現(xiàn)出類似腫瘤基因的作用,并且在惡性腫瘤的過度增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等各方面發(fā)揮出不同的作用。本實驗希望能夠進一步明確PDE7A在肝癌細胞中對增殖、遷移等方面的具體影響。方法：首先通過浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院肝癌患者的標(biāo)本資料庫提取90名肝癌患者的癌組織和癌旁組織,對其進行免疫組化檢測PDE7A的含量；對90名患者的術(shù)后生存期做長達五年的隨訪并做PDE7A相關(guān)的生存曲線分析。利用Western blotting技術(shù)對目前常用的肝癌細胞系,如HepG2、SK-Hep-1、HCC-LM3、 SMMC-7721和Huh-7等檢測PDE7A的表達量水平,確定實驗用細胞系。通過小干擾RNA(siRNA)技術(shù)抑制PDE7A在肝癌細胞中的表達量水平,構(gòu)建PDE7A正常表達組和PDE7A低表達組模型。利用流式細胞術(shù)分別檢測PDE7A正常表達組和PDE7A低表達組中細胞周期分布的變化；利用Western blotting技術(shù)分別檢測PDE7A正常表達組和PDE7A低表達組中有關(guān)的細胞周期調(diào)控蛋白的表達量水平。通過劃痕實驗以及Transwell實驗比較PDE7A正常表達組和PDE7A低表達組中細胞侵襲遷移能力的差異。EdU技術(shù)以及CCK8技術(shù)檢測比較PDE7A正常表達組和PDE7A低表達組細胞增殖能力的差異。結(jié)果：在我們所統(tǒng)計的90對肝癌組織和癌旁組織中,免疫組化的結(jié)果顯示約有53對組織中肝癌組織內(nèi)PDE7A的表達量高于癌旁組織。對90名患者手術(shù)后的生存分析結(jié)果顯示PDE7A高表達的患者五年存活率(27.9±6.2)明顯小于PDE7A低表達組的患者(55.4±8.9)。在常見的肝癌細胞系中,我們發(fā)現(xiàn)HCC-LM3細胞中PDE7A的表達量相對較高。通過siRNA技術(shù),我們對HCC-LM3細胞構(gòu)建了PDE7A正常表達組和PDE7A低表達組。Western blotting結(jié)果顯示PDE7A低表達組中周期相關(guān)蛋白的表達量較PDE7A正常表達組有明顯的下降。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示PDE7A低表達組中細胞周期大量阻滯在G2期。劃痕實驗以及Transwell結(jié)果提示PDE7A低表達組中細胞侵襲遷移能力受到了明顯的抑制。EdU技術(shù)和CCK8檢測結(jié)果均提示PDE7A低表達組中細胞增殖能力較PDE7A正常表達組明顯下降。結(jié)論：肝癌組織中PDE7A的表達量水平相對癌旁組織要高；腫瘤組織中PDE7A表達水平低的患者5年生存率相對要高；PDE7A低表達的HCC-LM3細胞周期相關(guān)蛋白的表達量水平也相對較低；PDE7A低表達的HCC-LM3細胞周期相對較多的阻滯在G2期；PDE7A低表達的HCC-LM3細胞侵襲遷移的能力相對受到明顯的抑制；PDE7A低表達的HCC-LM3細胞的增殖能力受到明顯的下調(diào)。第二部分磷酸二酯酶7A (PDE7A)促進體內(nèi)外肝癌細胞的Warburg效應(yīng)抑制其凋亡目的：比較在體內(nèi)環(huán)境以及體外環(huán)境中,PDE7A表達量水平的高低對腫瘤細胞的生長、腫瘤細胞的凋亡,以及對腫瘤特征性的Warburg效應(yīng)的影響。方法：利用第一部分中建立的PDE7A正常表達組和PDE7A低表達組,我們通過流式細胞術(shù)比較PDE7A正常表達組和PDE7A低表達組中細胞的凋亡水平的差異。利用Western blotting技術(shù)比較PDE7A正常表達組和PDE7A低表達組中凋亡相關(guān)蛋白的表達水平變化。通過檢測比較PDE7A正常表達組和PDE7A低表達組中乳酸含量的差異,比較體外環(huán)境中Warburg效應(yīng)的差異。利用裸鼠皮下成瘤技術(shù),構(gòu)建PDE7A正常表達和PDE7A低表達的體內(nèi)模型,通過比較體內(nèi)模型中PDE7A正常表達組和PDE7A低表達組腫瘤生長的大小、質(zhì)量,比較PDE7A在體內(nèi)對腫瘤細胞生長的影響。通過免疫組化技術(shù)比較體內(nèi)模型中PDE7A正常表達組和PDE7A低表達組形成的腫瘤中凋亡相關(guān)蛋白的表達量水平差異。通過免疫組化技術(shù)比較體內(nèi)模型中PDE7A正常表達組和PDE7A低表達組形成的腫瘤中Warburg效應(yīng)強度的差異。結(jié)果：根據(jù)流式細胞術(shù)的結(jié)果,體外實驗中PDE7A低表達組中,細胞的凋亡水平明顯增高；根據(jù)Western blotting的結(jié)果,體外實驗中PDE7A低表達組中,細胞凋亡相關(guān)的蛋白表達水平明顯增高；根據(jù)乳酸產(chǎn)量的測定結(jié)果,體外實驗中PDE7A低表達組中,細胞Warburg效應(yīng)受到明顯的抑制。在體內(nèi)實驗的模型中,PDE7A低表達組的腫瘤細胞生長速度明顯受限；PDE7A低表達組的PARP表達量明顯增加；PDE7A低表達組中的Warburg效應(yīng)明顯減弱。結(jié)論：本實驗證明了在體外模型中PDE7A表達量的降低可以促進細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達量水平升高；可以促進腫瘤細胞的早期凋亡；可以明顯的抑制腫瘤的Warburg效應(yīng)。在體內(nèi)模型中,同樣的PDE7A低表達組可以明顯的抑制腫瘤的生長；能夠促進凋亡相關(guān)蛋白的表達；能夠抑制Warburg效應(yīng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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本文編號：2455705