【摘要】：骨肉瘤是最為常見(jiàn)的骨原發(fā)惡性腫瘤,其發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)呈現(xiàn)逐年升高的趨勢(shì)。骨肉瘤通常來(lái)源于原始的間充質(zhì)來(lái)源的轉(zhuǎn)化細(xì)胞,如股骨遠(yuǎn)端,脛骨近端和肱骨近端,一般好發(fā)于二十歲左右的青年。針對(duì)DNA甲基化的修飾,已成為腫瘤治療的一種新型靶點(diǎn)。DNA高甲基化在促使腫瘤抑制基因沉默的過(guò)程中起到了至關(guān)重要的作用,已成為人類癌癥的研究熱點(diǎn),而這種現(xiàn)象與經(jīng)典的基因突變具有相似的意義。甲基化Cp G結(jié)合蛋白(methyl-Cp G binding proteins,MBDs)是招募染色體沉默相關(guān)復(fù)合物結(jié)合到甲基化DNA上的重要橋梁分子,是介導(dǎo)高甲基化DNA抑制基因轉(zhuǎn)錄的重要蛋白家族,在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中異常高甲基化區(qū)域的出現(xiàn)使得MBD蛋白可能成為有意義的治療靶點(diǎn)。目前針對(duì)表觀遺傳修飾的藥物最大的缺點(diǎn)是會(huì)引起基因組低甲基化,導(dǎo)致整個(gè)基因組不穩(wěn)定,因此研究以MBD蛋白為靶點(diǎn)的針對(duì)表觀遺傳學(xué)的抗腫瘤治療比以DNA甲基轉(zhuǎn)移酶為靶點(diǎn)的抗腫瘤治療更具特異性,可減少副作用。在前期研究中,我們建立了成骨細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的模型,并利用基因芯片發(fā)現(xiàn)印跡基因TSSC3參與了成骨細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化,TSSC3啟動(dòng)子區(qū)呈高甲基化,TSSC3的表達(dá)沉默在骨肉瘤細(xì)胞獲得失巢凋亡抵抗中起著至關(guān)重要的作用。TSSC3作為一種潛在的抑癌基因,可能成為骨肉瘤治療的一個(gè)新靶標(biāo)。我們?cè)O(shè)想,MBD蛋白可能在介導(dǎo)骨肉瘤TSSC3基因表達(dá)沉默中起作用。通常情況下,MBD蛋白,如甲基化Cp G結(jié)合蛋白2(Me CP2),甲基化Cp G結(jié)合域1(MBD1)以及MBD2,能夠特異性的結(jié)合甲基化的Cp G,同時(shí)與組蛋白去乙�；�(HDAC)相關(guān)。甲基化Cp G結(jié)合蛋白2(Methyl-Cp G-binding protein 2,Me CP2)是MBDs蛋白家族中被研究最為廣泛的蛋白。Me CP2是人腦發(fā)育的必需蛋白,而且,Me CP2與許多的癌癥和神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病密切相關(guān)。本研究采用染色質(zhì)免疫沉淀法,首先通過(guò)四對(duì)引物檢測(cè)Me CP2蛋白結(jié)合TSSC3基因的活性;然后選擇兩個(gè)特異性si RNA,在LV-Me CP2-RNAi處理過(guò)的細(xì)胞中觀察Me CP2基因表達(dá);CCK8檢測(cè)空白LV-Me CP2-RNAi-CN與轉(zhuǎn)染LV-Me CP2-RNAi的Sa OS2和U2OS細(xì)胞增殖水平的差異;通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)和Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LV-Me CP2-RNAi對(duì)于U2OS和Sa OS2細(xì)胞遷移侵襲能力的影響;應(yīng)用流式細(xì)胞分析U2OS和Sa OS2細(xì)胞的凋亡情況;細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LV-Me CP2-RNAi對(duì)于U2OS和Sa OS2細(xì)胞的抑制情況;通過(guò)建立U2OS和Sa OS2裸鼠皮下移植瘤模型,分為轉(zhuǎn)染LV-Me CP2-RNAi組和未轉(zhuǎn)染LV-Me CP2-RNAi組,之后測(cè)量移植瘤的體積;最后通過(guò)基因芯片篩選出與Me CP2相關(guān)的具有生物學(xué)意義的差異表達(dá)基因;通過(guò)硫化測(cè)序PCR法(Bisulfite Sequencing PCR,BSP)檢測(cè)IGFBP4基因啟動(dòng)子區(qū)的Cp G甲基化水平。目的在于探索Me CP2在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制,并以此為基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn)骨肉瘤的新的治療靶點(diǎn)。主要結(jié)果如下:1.染色質(zhì)免疫沉淀法檢測(cè)Me CP2蛋白結(jié)合TSSC3基因的活性,結(jié)果顯示Me CP2在U2OS和Sa OS2細(xì)胞中表達(dá)顯著升高,表明Me CP2與TSSC3基因擁有最強(qiáng)的結(jié)合力。2.選擇兩個(gè)特異性si RNA,在LV-Me CP2-RNAi處理過(guò)的細(xì)胞中觀察Me CP2基因表達(dá),與對(duì)照細(xì)胞相比,LV-Me CP2-RNAi能降低Me CP2基因在U2OS和Sa OS2細(xì)胞中的表達(dá),但同時(shí)也降低了TSSC3的表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.CCK8實(shí)驗(yàn)顯示LV-Me CP2-RNAi可抑制Sa OS2和U2OS細(xì)胞增殖力,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.劃痕實(shí)驗(yàn)和Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LV-Me CP2-RNAi對(duì)于U2OS和Sa OS2細(xì)胞侵襲能力的影響,結(jié)果顯示,與空白LV-Me CP2-RNAi-CN轉(zhuǎn)染組相比,轉(zhuǎn)染LV-Me CP2-RNAi組U2OS和Sa OS2細(xì)胞侵襲和遷移能力受到明顯抑制,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5.應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)分析了U2OS和Sa OS2細(xì)胞的凋亡情況,結(jié)果顯示與空白LV-Me CP2-RNAi-CN轉(zhuǎn)染組相比,轉(zhuǎn)染LV-Me CP2-RNAi組U2OS和Sa OS2細(xì)胞凋亡率增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。6.細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示LV-MECP2-RNAi可抑制Sa OS2和U2OS細(xì)胞克隆形成。結(jié)果提示LV-Me CP2-RNAi抑制U2OS和Sa OS2的體外成瘤能力,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。7.裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)顯示LV-Me CP2-RNAi可抑制Sa OS2和U2OS細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。8.通過(guò)基因芯片從49395個(gè)轉(zhuǎn)錄子中篩選出107個(gè)差異表達(dá)基因,34基因表達(dá)上調(diào),73個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。其中5個(gè)基因與骨肉瘤細(xì)胞增殖的功能改變密切相關(guān),它們包括IGFBP4,HOXC8,LMO4,MDK和CTGF。9.通過(guò)硫化測(cè)序PCR法(Bisulfite Sequencing PCR,BSP)檢測(cè)IGFBP4基因的Cp G甲基化,結(jié)果顯示IGFBP4基因序列P1區(qū)Cp G島顯著的高甲基化。10.LV-Me CP2-RNAi能降低Me CP2基因在U2OS和Sa OS2細(xì)胞中的表達(dá),同時(shí)增高了IGFBP4的表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。主要結(jié)論如下:1.在骨肉瘤U2OS和Sa OS2細(xì)胞中,三種甲基化Cp G結(jié)合蛋白中Me CP2與TSSC3基因擁有最強(qiáng)的結(jié)合力,但這種作用并不是調(diào)節(jié)TSSC3表達(dá)的主要機(jī)制,具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。2.Me CP2的基因沉默可以阻斷Me CP2的表達(dá),抑制骨肉瘤U2OS和Sa OS2細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移及成瘤能力,并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。3.Me CP2基因參與骨肉瘤細(xì)胞的增殖調(diào)控過(guò)程。其中IGFBP4、HOXC8、LMO4、MDK和CTGF基因可能參與了Me CP2介導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞增殖的過(guò)程。4.骨肉瘤Sa OS2細(xì)胞中IGFBP4基因可能是Me CP2的靶向分子,可以通過(guò)RNAi阻斷降低Me CP2的表達(dá)水平,恢復(fù)IGFBP4的部分表達(dá)及抑制腫瘤的功能,從而改變腫瘤細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R738

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9 朱U，

本文編號(hào)：2453881