【摘要】：背景干細(xì)胞具有自我更新和多向分化能力,這是維持組織和器官結(jié)構(gòu)與功能穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵因素之一。人體衰老和老年性疾病的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體干細(xì)胞衰老有密切關(guān)系。研究證明。造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells,HSC)衰老與多種老年性疾病密切相關(guān),主要表現(xiàn)為造血系統(tǒng)衰退所致的嚴(yán)重貧血,免疫系統(tǒng)低下所致的防御功能降低,細(xì)胞增殖分化失控所致的白血病發(fā)生等。研究證明,隨著年齡的逐步增加,造血誘導(dǎo)微環(huán)境的生態(tài)龕數(shù)量減少和功能衰退,進(jìn)而導(dǎo)致HSC數(shù)量減少和功能低下,最終伴隨相關(guān)老年性疾病的發(fā)生。因此干細(xì)胞是研究細(xì)胞衰老的重要模型,深入研究干細(xì)胞衰老和延緩干細(xì)胞衰老的現(xiàn)代生物學(xué)機(jī)理,不僅對推動人體衰老問題的研究有重大的科學(xué)意義,而且在預(yù)防老年疾病和治療退行性疾病中有不可估量的社會價值。造血誘導(dǎo)微環(huán)境(HIM)是HSC賴以生存和增殖分化的場所,HIM不僅是HSC生存的支架,它還產(chǎn)生諸多造血調(diào)控因子,影響細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對其功能起著重要調(diào)控作用�，F(xiàn)代造血理論認(rèn)為,HIM的核心成分是骨髓基質(zhì)細(xì)胞,它構(gòu)成特定的生態(tài)龕調(diào)控HSC的功能,骨髓基質(zhì)細(xì)胞是多種細(xì)胞組成的混合細(xì)胞群,它們大多起源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCS)。因此闡釋造血干細(xì)胞衰老機(jī)制需要同步研究BMSCS對其衰老的影響。慢性髓細(xì)胞白血病(chronic myelocytic leukemia,CML)是一種造血干細(xì)胞克隆增生性疾病,骨髓以髓系細(xì)胞增生,外周血以白細(xì)胞增多和脾腫大為主要特征,以老年人的患病率較高。研究證明,白血病的發(fā)生發(fā)展與白血病干細(xì)胞(leukemia stem cell,LSCS)密切相關(guān)。目前認(rèn)為,LSCS由正常HSC演化而來,尤其HSC衰老或HIM變化是形成LSCS的關(guān)鍵因素,同時LSCS也是臨床治療白血病的難點(diǎn)所在。迄今白血病的根治除了HSC移植外沒有理想的治療手段,但該治療手段復(fù)雜,尤其是難以獲得理想的供體細(xì)胞,且花費(fèi)巨大,大多數(shù)患者并沒有治療機(jī)會。如何治愈白血病仍是醫(yī)學(xué)界難以攻克的瓶頸。如果尋找到既能抑制白血病細(xì)胞增殖分化,又能對骨髓正常造血細(xì)胞有良好保護(hù)作用的天然藥物有效成分將對白血病等腫瘤的治療帶來新的治療途徑。當(dāng)歸是中醫(yī)臨床“補(bǔ)血、活血”要藥,當(dāng)歸多糖(ASP)是其主要藥物活性成分之一。我們多年的研究證明,ASP對HSC的增殖分化有重要調(diào)控作用,且可以延緩HSC衰老,促進(jìn)貧血動物骨髓造血功能,對免疫器官有良好保護(hù)作用。最近我們研究發(fā)現(xiàn),ASP能促進(jìn)LSCS的衰老,對移植性白血病有較好的治療效果。但ASP的“雙向調(diào)節(jié)”作用機(jī)理尚不清楚。目的本文將現(xiàn)代干細(xì)胞最新理論和技術(shù)與傳統(tǒng)中醫(yī)“氣血理論”和衰老理論結(jié)合研究如下內(nèi)容1.隨年齡增加小鼠與人骨髓HSC/HPCS與BMSCS衰老的生物學(xué)特點(diǎn);2.ASP調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對LSCS的影響;3.ASP調(diào)控BMSCS衰老抑制LSCS作用機(jī)理。研究對闡釋干細(xì)胞衰老理論和中醫(yī)學(xué)“氣血理論”有重要的理論價值;對臨床治療白血病有重要的應(yīng)用價值。方法1.雄性C57BL/6小鼠,分為幼年組(A組,3~4周齡),青年組(B組,2月齡),中年組(C組,6月齡),中老年組(D組,12月齡),老年組(E組,18月齡)。提取各組小鼠骨髓單個核細(xì)胞,用本課題組改良MACS分離法分選純化Sca-1+細(xì)胞群。衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色觀察各年齡組陽性細(xì)胞百分比,造血祖細(xì)胞混合集落(CFU-Mix)培養(yǎng)比較各年齡組Sca-1+細(xì)胞集落形成能力。2.取正常人骨髓,分為青年組(3例,26~31歲),中年組(3例,52~59歲)與老年組(3例,62~70歲),改良MACS分選出各組骨髓CD34+CD38-細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測其純度,臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞存活率,SA-β-gal染色檢測各組細(xì)胞衰老情況。3.分離各組人骨髓單個核細(xì)胞,體外貼壁培養(yǎng)14-21天,倒置鏡下計數(shù)細(xì)胞數(shù)50的成纖維細(xì)胞集落形成單位(CFU-F)個數(shù)。取第3代BMSCS,流式細(xì)胞術(shù)檢測CD34,CD45,CD73,CD90,and CD105細(xì)胞表型,SA-β-gal染色觀察各年齡組陽性細(xì)胞百分比,CCK-8檢測比較各年齡組BMSCS形成CFU-F的能力。4.取正常人骨髓3例。慢性髓細(xì)胞白血病患者骨髓5例,分別分為對照組與ASP組。對照組,進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng);ASP組,在培養(yǎng)體系中加10μg/ml當(dāng)歸多糖,其它條件同于對照組。分別計數(shù)各組CFU-F數(shù)量,CCK-8檢測各組BMSCS增殖情況,SA-β-gal染色檢測衰老細(xì)胞陽性率。堿性磷酸酶染色檢測各組BMSCS的成骨分化能力,油紅O染色檢測BMSCS成脂分化能力。5.檢測上述各組BMSCS內(nèi)SOD,總谷胱甘肽,MDA,超氧化物的含量,觀察各組細(xì)胞的氧化損傷及抗氧化能力。Elisa檢測血管生成素Ⅰ含量,了解各組BMSCS的對造血系統(tǒng)的支持作用。6.RT-PCR和Western blotting檢測各組人BMSCS衰老相關(guān)基因p16INK4a、p19Arf、p53、p21Cip1/Waf1m RNA及衰老相關(guān)蛋白P16INK4a、P21Cip1/Waf1、P19、P53表達(dá)的改變。7.將培養(yǎng)了三代的各組BMSCS分別加入到帶Transwell的六孔板的下層,將LSCS分別加入transwell的上層,每孔各106個LSCS。培養(yǎng)24h,取出上層的CD34+CD38-細(xì)胞進(jìn)行CFU-Mix培養(yǎng)及CCK-8增殖能力檢測。結(jié)果1.MACS分選前小鼠Sca-1+細(xì)胞百分比為(1.02 0.19)%;MACS分離純化后Sca-1+細(xì)胞純度可達(dá)(93.66±0.83)%。各年齡組分選前后Sca-1細(xì)胞純度百分比無統(tǒng)計學(xué)差別。MACS分離純化前每106個BMNCs中CD34+CD38-細(xì)胞群比例為1.76±0.34%;MACS分離純化后每106個細(xì)胞中CD34+CD38-細(xì)胞群比例為91.15±2.41%。各組人BMSCS高表達(dá)CD73,CD90,CD105抗原,低表達(dá)CD34,CD45抗原。2.青年組,中年組與老年組人每107個BMNS形成CFU-F能力隨年齡增加逐漸下降;人CD34+CD38-細(xì)胞形成CFU-Mix數(shù)量隨年齡增加逐步下降降低,集落中的細(xì)胞數(shù)也逐漸減少;人BMSCS的SA-β-gal染色陽性率隨年齡增加逐漸升高。幼年組,青年組,中年組,中老年組和老年組小鼠Sca-1+HSC/HPCSs形成CFU-Mix數(shù)量隨年齡增加逐漸降低,集落中細(xì)胞數(shù)也逐漸減少;SA-β-gal染色小鼠BMSCS陽性細(xì)胞數(shù)隨年齡增加逐漸升高。小鼠或人BMSCS的增殖情況均隨年齡呈現(xiàn)逐步降低趨勢。3.LSCS與BMSCS共培養(yǎng)結(jié)果表明,空白對照組和白血病組的LSCS集落數(shù)量明顯高于其它組,集落中細(xì)胞數(shù)也高于其它組。ASP組LSCS集落數(shù)量明顯少于白血病組,提示ASP干預(yù)的BMSCS有抑制LSCS增殖的作用,ASP作用BMSCS可以延緩其衰老。4.CML患者的BMSCS與健康人的BMSCS比較,形成CFU-F能力下降,而ASP作用CML患者的BMSCS后,形成CFU-F能力明顯提高。SA-β-gal染色陽性的人BMSCS數(shù)在白血病組顯著增加,而ASP組的SA-β-gal染色陽性的細(xì)胞數(shù)明顯降低。白血病組的BMSCS成骨、成脂分化能力明顯降低,而ASP組的BMSCS成骨、成脂分化能力明顯高于白血病組。白血病組BMSCS的SOD,總谷胱甘肽與血管生成素Ⅰ含量明顯降低,而MDA及超氧化物均明顯增高,而ASP組BMSCS的SOD,總谷胱甘肽與血管生成素Ⅰ的含量明顯提高,而MDA及超氧化物均明顯降低。說明CML患者BMSCS較健康人的BMSCS出現(xiàn)明顯衰老,而ASP可以延緩其衰老。5.PCR結(jié)果顯示p16INK4a,p19Arf,p53,p21Cip1/Waf1基因在各組人BMSCS中均有表達(dá),白血病組p16INK4a、p19Arf、p53、p21Cip1/Waf1m RNA表達(dá)水平顯著高于其它各組,ASP組相應(yīng)基因表達(dá)水平低于白血病組,Western Blot結(jié)果提示各組人BMSCS均有所表達(dá)P16INK4a、P21Cip1/Waf1、P53、P19蛋白,白血病組表達(dá)明顯增高,ASP組相應(yīng)蛋白表達(dá)低于白血病組,提示ASP能延緩人BMSCS衰老,其機(jī)理可能與ASP調(diào)控p16INK4a-Rb和p19Arf-Mdm2-p53-p21Cip1/Waf1信號通路有關(guān)。結(jié)論1.隨年齡增加小鼠和人類的HSC及BMSCS均會出現(xiàn)衰老,表現(xiàn)為增殖分化能力下降等,這兩種細(xì)胞的衰老可能存在相互關(guān)聯(lián)。2.隨著年齡的增加,人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞出現(xiàn)衰老,對造血系統(tǒng)尤其是造血干細(xì)胞的支持作用下降,這可能會導(dǎo)致造血干細(xì)胞變成增殖性很強(qiáng)的白血病干細(xì)胞,于是患上白血病。且有白血病干細(xì)胞的存在,白血病的治療效果不好,容易復(fù)發(fā)。本部分實驗提示當(dāng)歸多糖可能可以通過延緩間充質(zhì)干細(xì)胞衰老抑制白血病干細(xì)胞的增殖分化,進(jìn)而抑制白血病干細(xì)胞的產(chǎn)生,降低慢性髓細(xì)胞白血病的患病率。3.當(dāng)歸多糖可以調(diào)控CML骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衰老,從而抑制白血病干細(xì)胞的增殖,其可能的機(jī)理是通過提高細(xì)胞的抗氧化能力和降低細(xì)胞氧化損傷。也可能與p16INK4a-Rb和p19Arf-Mdm2-p53-p21Cip1/Waf1信號通路的調(diào)控有關(guān)。這個發(fā)現(xiàn)可以成為我們今后探索治療CML的新方法的新途徑。
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【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R733.72

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2453588