【摘要】：研究目的:肝癌是一種發(fā)病率與死亡率均很高的惡性腫瘤,在我們國(guó)家其發(fā)病率更是居全球之首。肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是肝癌中最主要的組織學(xué)亞型,其發(fā)病率正在逐年增加。對(duì)于絕大部分不適合手術(shù)的HCC患者而言,采用化療藥物進(jìn)行姑息治療是目前臨床上唯一的治療策略。但是臨床上除索拉非尼外缺乏公認(rèn)的有效藥物,對(duì)于索拉非尼不耐受或者不敏感的晚期HCC病人而言,目前臨床上多尋求于其他化療藥物的聯(lián)合應(yīng)用。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)新型EGFR酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼與傳統(tǒng)細(xì)胞毒類化療藥物伊立替康的活性代謝物SN-38在HCC細(xì)胞株上展現(xiàn)了很好的合用效果,基于此,本課題擬進(jìn)一步探究伊立替康與吉非替尼聯(lián)合應(yīng)用治療肝癌的藥效學(xué)及相關(guān)機(jī)制,為臨床用藥與研究提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究方法:1.研究伊立替康與吉非替尼聯(lián)合應(yīng)用的體內(nèi)外抗肝癌效果:采用SRB比色法與克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SN-38與吉非替尼單用/合用對(duì)于HCC細(xì)胞(Hep G-2、BEL-7402)的增殖抑制作用;在Hep G-2裸小鼠移植瘤模型上考察伊立替康與吉非替尼單用/合用對(duì)于腫瘤的抑制作用。2.檢測(cè)兩藥合用時(shí)HCC細(xì)胞的凋亡水平:利用Annexin-V(膜聯(lián)蛋白-V)-PI(碘化丙啶)雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SN-38與吉非替尼單用/合用后HCC細(xì)胞(Hep G-2、BEL-7402)凋亡率;利用Western Blot法檢測(cè)HCC細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)水平;利用DAPI染色觀察HCC細(xì)胞凋亡后的核固縮與凋亡小體的形成。3.明確兩藥合用效果與肝癌細(xì)胞DNA損傷應(yīng)答之間的關(guān)系:利用Western Blot法檢測(cè)SN-38與吉非替尼單用/合用后HCC細(xì)胞(Hep G-2、BEL-7402)DNA損傷應(yīng)答相關(guān)蛋白的表達(dá)水平;利用免疫熒光法觀察DNA雙鏈損傷標(biāo)記物γ-H2AX于細(xì)胞核內(nèi)的聚集情況;利用蛋白合成抑制劑CHX、溶酶體抑制劑氯喹與蛋白酶體抑制劑MG132結(jié)合Western Blot法研究Rad51的降解與兩藥合用療效增強(qiáng)之間的關(guān)系。研究結(jié)果:1.伊立替康與吉非替尼合用在肝癌治療中的藥效學(xué)研究:(1)在體外,SN-38與Gefitinib于HCC細(xì)胞株上(Hep G-2、BEL-7402)作用48h,SRB法檢測(cè)結(jié)果表明到兩藥合用能夠顯著抑制HCC細(xì)胞增殖,合用指數(shù)(CI)也顯示兩藥合用有協(xié)同作用,另外克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了兩藥合用能夠增加對(duì)HCC細(xì)胞增殖的抑制作用。(2)在體內(nèi),通過接種Hep G-2建立裸小鼠移植瘤模型對(duì)伊立替康與吉非替尼兩藥合用的體內(nèi)抗肝癌效果進(jìn)行考察,結(jié)果顯示兩藥合用(Irinotecan 1mg/kg,Gefitinib 100mg/kg)比兩藥各自單獨(dú)使用更加能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng),具有協(xié)同治療作用。2.伊立替康與吉非替尼合用在肝癌治療中發(fā)揮協(xié)同作用的機(jī)制研究:(1)吉非替尼增強(qiáng)SN-38誘導(dǎo)HCC細(xì)胞發(fā)生Caspase依賴的細(xì)胞凋亡:(1)SN-38與吉非替尼于HCC細(xì)胞株上(Hep G-2、BEL-7402)作用36h,Annexin-V(膜聯(lián)蛋白-V)-PI(碘化丙啶)雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示兩藥合用能夠明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡;(2)DAPI染色結(jié)果顯示兩藥合用后細(xì)胞發(fā)生核固縮、凋亡小體增加,呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡狀態(tài);(3)Western Blot結(jié)果顯示,兩藥合用能夠明顯增加凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平,而在泛Caspase抑制劑作用后,細(xì)胞凋亡水平得到了顯著回降,提示兩藥合用促進(jìn)細(xì)胞凋亡是Caspase依賴的。(2)在HCC細(xì)胞上SN-38與吉非替尼聯(lián)合應(yīng)用能導(dǎo)致明顯的DNA損傷:(1)免疫熒光結(jié)果顯示兩藥合用6h后DNA損傷標(biāo)志γ-H2AX于細(xì)胞核內(nèi)聚集,提示DNA損傷的增加;(2)Western Blot結(jié)果顯示兩藥合用6h后γ-H2AX與另一DNA損傷標(biāo)志蛋白p53的表達(dá)水平均有上升,進(jìn)一步明確了DNA損傷的加劇。(3)兩藥合用能夠通過細(xì)胞同源重組修復(fù)的缺陷而導(dǎo)致DNA損傷的積累:(1)Western Blot結(jié)果顯示兩藥合用6h后細(xì)胞DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白CHK1與CHK2的磷酸化水平上升,表明DNA損傷修復(fù)的啟動(dòng),而另一下游DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白R(shí)ad51的表達(dá)水平有所下降;(2)兩藥分別合用12h/24h后,吉非替尼與合用組的Rad51表達(dá)水平進(jìn)一步下降,提示吉非替尼可能通過抑制Rad51而阻礙細(xì)胞同源重組修復(fù)而導(dǎo)致SN-38誘導(dǎo)的DNA損傷的積累,從而增加了SN-38的藥效。(4)泛素蛋白酶體通路與吉非替尼誘導(dǎo)的Rad51表達(dá)抑制相關(guān):(1)Western Blot結(jié)果顯示吉非替尼與Rad51蛋白水平的下降存在量效/時(shí)效關(guān)系;(2)蛋白合成抑制劑CHX與溶酶體抑制劑氯喹并不能逆轉(zhuǎn)吉非替尼作用下的Rad51表達(dá)水平的下降,而蛋白酶體抑制劑MG132則能逆轉(zhuǎn)此現(xiàn)象,提示吉非替尼誘導(dǎo)的Rad51表達(dá)水平的降低可能與泛素蛋白酶體通路相關(guān)。研究結(jié)論:(1)伊立替康與吉非替尼合用能夠抑制HCC細(xì)胞株的增殖和腫瘤的生長(zhǎng),協(xié)同發(fā)揮抗肝癌作用。(2)吉非替尼通過引發(fā)蛋白酶體依賴的Rad51下調(diào)造成細(xì)胞同源重組修復(fù)阻礙,導(dǎo)致DNA損傷加劇進(jìn)而誘導(dǎo)HCC細(xì)胞發(fā)生Caspase依賴的細(xì)胞凋亡,從而增強(qiáng)伊立替康的體內(nèi)外抗肝癌效果。
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【學(xué)位授予單位】：浙江工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：2451356