發(fā)布時間：2019-04-01 07:19

【摘要】：研究目的:肝癌是一種發(fā)病率與死亡率均很高的惡性腫瘤,在我們國家其發(fā)病率更是居全球之首。肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是肝癌中最主要的組織學亞型,其發(fā)病率正在逐年增加。對于絕大部分不適合手術的HCC患者而言,采用化療藥物進行姑息治療是目前臨床上唯一的治療策略。但是臨床上除索拉非尼外缺乏公認的有效藥物,對于索拉非尼不耐受或者不敏感的晚期HCC病人而言,目前臨床上多尋求于其他化療藥物的聯(lián)合應用。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)新型EGFR酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼與傳統(tǒng)細胞毒類化療藥物伊立替康的活性代謝物SN-38在HCC細胞株上展現(xiàn)了很好的合用效果,基于此,本課題擬進一步探究伊立替康與吉非替尼聯(lián)合應用治療肝癌的藥效學及相關機制,為臨床用藥與研究提供一定的實驗依據(jù)。研究方法:1.研究伊立替康與吉非替尼聯(lián)合應用的體內外抗肝癌效果:采用SRB比色法與克隆形成實驗檢測SN-38與吉非替尼單用/合用對于HCC細胞(Hep G-2、BEL-7402)的增殖抑制作用;在Hep G-2裸小鼠移植瘤模型上考察伊立替康與吉非替尼單用/合用對于腫瘤的抑制作用。2.檢測兩藥合用時HCC細胞的凋亡水平:利用Annexin-V(膜聯(lián)蛋白-V)-PI(碘化丙啶)雙染法結合流式細胞術檢測SN-38與吉非替尼單用/合用后HCC細胞(Hep G-2、BEL-7402)凋亡率;利用Western Blot法檢測HCC細胞凋亡蛋白的表達水平;利用DAPI染色觀察HCC細胞凋亡后的核固縮與凋亡小體的形成。3.明確兩藥合用效果與肝癌細胞DNA損傷應答之間的關系:利用Western Blot法檢測SN-38與吉非替尼單用/合用后HCC細胞(Hep G-2、BEL-7402)DNA損傷應答相關蛋白的表達水平;利用免疫熒光法觀察DNA雙鏈損傷標記物γ-H2AX于細胞核內的聚集情況;利用蛋白合成抑制劑CHX、溶酶體抑制劑氯喹與蛋白酶體抑制劑MG132結合Western Blot法研究Rad51的降解與兩藥合用療效增強之間的關系。研究結果:1.伊立替康與吉非替尼合用在肝癌治療中的藥效學研究:(1)在體外,SN-38與Gefitinib于HCC細胞株上(Hep G-2、BEL-7402)作用48h,SRB法檢測結果表明到兩藥合用能夠顯著抑制HCC細胞增殖,合用指數(shù)(CI)也顯示兩藥合用有協(xié)同作用,另外克隆形成實驗進一步驗證了兩藥合用能夠增加對HCC細胞增殖的抑制作用。(2)在體內,通過接種Hep G-2建立裸小鼠移植瘤模型對伊立替康與吉非替尼兩藥合用的體內抗肝癌效果進行考察,結果顯示兩藥合用(Irinotecan 1mg/kg,Gefitinib 100mg/kg)比兩藥各自單獨使用更加能夠抑制腫瘤的生長,具有協(xié)同治療作用。2.伊立替康與吉非替尼合用在肝癌治療中發(fā)揮協(xié)同作用的機制研究:(1)吉非替尼增強SN-38誘導HCC細胞發(fā)生Caspase依賴的細胞凋亡:(1)SN-38與吉非替尼于HCC細胞株上(Hep G-2、BEL-7402)作用36h,Annexin-V(膜聯(lián)蛋白-V)-PI(碘化丙啶)雙染法結合流式細胞術結果顯示兩藥合用能夠明顯促進細胞凋亡;(2)DAPI染色結果顯示兩藥合用后細胞發(fā)生核固縮、凋亡小體增加,呈現(xiàn)明顯的細胞凋亡狀態(tài);(3)Western Blot結果顯示,兩藥合用能夠明顯增加凋亡相關蛋白表達水平,而在泛Caspase抑制劑作用后,細胞凋亡水平得到了顯著回降,提示兩藥合用促進細胞凋亡是Caspase依賴的。(2)在HCC細胞上SN-38與吉非替尼聯(lián)合應用能導致明顯的DNA損傷:(1)免疫熒光結果顯示兩藥合用6h后DNA損傷標志γ-H2AX于細胞核內聚集,提示DNA損傷的增加;(2)Western Blot結果顯示兩藥合用6h后γ-H2AX與另一DNA損傷標志蛋白p53的表達水平均有上升,進一步明確了DNA損傷的加劇。(3)兩藥合用能夠通過細胞同源重組修復的缺陷而導致DNA損傷的積累:(1)Western Blot結果顯示兩藥合用6h后細胞DNA損傷修復相關蛋白CHK1與CHK2的磷酸化水平上升,表明DNA損傷修復的啟動,而另一下游DNA損傷修復相關蛋白Rad51的表達水平有所下降;(2)兩藥分別合用12h/24h后,吉非替尼與合用組的Rad51表達水平進一步下降,提示吉非替尼可能通過抑制Rad51而阻礙細胞同源重組修復而導致SN-38誘導的DNA損傷的積累,從而增加了SN-38的藥效。(4)泛素蛋白酶體通路與吉非替尼誘導的Rad51表達抑制相關:(1)Western Blot結果顯示吉非替尼與Rad51蛋白水平的下降存在量效/時效關系;(2)蛋白合成抑制劑CHX與溶酶體抑制劑氯喹并不能逆轉吉非替尼作用下的Rad51表達水平的下降,而蛋白酶體抑制劑MG132則能逆轉此現(xiàn)象,提示吉非替尼誘導的Rad51表達水平的降低可能與泛素蛋白酶體通路相關。研究結論:(1)伊立替康與吉非替尼合用能夠抑制HCC細胞株的增殖和腫瘤的生長,協(xié)同發(fā)揮抗肝癌作用。(2)吉非替尼通過引發(fā)蛋白酶體依賴的Rad51下調造成細胞同源重組修復阻礙,導致DNA損傷加劇進而誘導HCC細胞發(fā)生Caspase依賴的細胞凋亡,從而增強伊立替康的體內外抗肝癌效果。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：浙江工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 林麗珊;張力;趙洪云;林立平;吳p，

本文編號：2451356