【摘要】：目的:FBW7(F-box and WD repeat domain-containing7,FBW7)是F-box蛋白家族成員,為SCF型泛素連接酶復(fù)合物中識(shí)別底物的蛋白分子,介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)的泛素化降解。FBW7是一個(gè)抑癌蛋白,通過調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、周期和凋亡相關(guān)蛋白的降解參與了腫瘤發(fā)生和發(fā)展的眾多生物學(xué)過程。我們前期研究發(fā)現(xiàn)FBW7在Gefitinib敏感的親本細(xì)胞和相應(yīng)的耐藥細(xì)胞中存在差異性表達(dá),細(xì)胞耐藥后FBW7表達(dá)減少。我們將通過以下方案研究FBW7調(diào)控Gefitinib敏感性的分子機(jī)制,并探討以FBW7為靶點(diǎn)逆轉(zhuǎn)Gefitinib耐藥的研究策略。方法:1、Gefitinib從10 nM開始處理PC-9親本細(xì)胞,每2周加倍Gefitinib濃度,連續(xù)培養(yǎng)6個(gè)月獲得耐藥細(xì)胞PC-9GR,EGFR基因測(cè)序和FISH檢測(cè)PC-9GR是否出現(xiàn)T790M和Met擴(kuò)增;2、通過PCR和Western blot方法比較親本細(xì)胞與耐藥細(xì)胞FBW7在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)情況;3、通過shRNA下調(diào)親本細(xì)胞PC-9和HCC827 FBW7表達(dá),觀察細(xì)胞是否出現(xiàn)Gefitinib耐藥性;4、明確FBW7調(diào)控Gefitinib敏感性的分子機(jī)制,探究Bcl-2家族抗凋亡蛋白Mcl-1在該過程中的作用。結(jié)果:1、MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)PC-9GR對(duì)Gefitinib耐藥,基因測(cè)序和FISH未發(fā)現(xiàn)T790M與Met基因擴(kuò)增;2、親本細(xì)胞FBW7在mRNA和蛋白質(zhì)兩個(gè)表達(dá)水平均高于相應(yīng)耐藥細(xì)胞;3、shRNA慢病毒感染親本細(xì)胞,PCR和Western blot驗(yàn)證FBW7下調(diào)效率,MTT、流式細(xì)胞術(shù)和Western blot等功能學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)親本細(xì)胞在FBW7表達(dá)下調(diào)后對(duì)Gefitinib敏感性降低,細(xì)胞出現(xiàn)耐藥表型;4、親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞Bcl-2家族蛋白存在差異性表達(dá),其中Mcl-1的差異最顯著。FBW7通過降解抗凋亡蛋白Mcl-1和調(diào)控Mcl-1半衰期t1/2影響細(xì)胞對(duì)Gefitinib敏感性。結(jié)論:1、FBW7在PC-9和HCC827親本細(xì)胞表達(dá)量高于耐藥細(xì)胞PC-9GR和HCC827GR5、HCC827GR6,并且PC-9GR不存在已知的耐藥機(jī)制T790M與Met擴(kuò)增,提示FBW7表達(dá)下調(diào)可能是Gefitinib耐藥的一個(gè)新機(jī)制;2、下調(diào)親本細(xì)胞FBW7表達(dá),PC-9和HCC827對(duì)Gefitinib敏感性降低,Gefitinib IC50增加且細(xì)胞凋亡比例降低,推測(cè)下調(diào)FBW7表達(dá)可能穩(wěn)定抗凋亡分子,抗凋亡分子表達(dá)在凋亡刺激下不發(fā)生減少,最終導(dǎo)致親本細(xì)胞對(duì)Gefitinib耐藥;3、下調(diào)FBW7表達(dá)可以穩(wěn)定抗凋亡蛋白Mcl-1,減少M(fèi)cl-1降解,延長(zhǎng)Mcl-1的半衰期t1/2,后者可能是導(dǎo)致Gefitinib耐藥的關(guān)鍵分子。
[Abstract]:Objective: FBW7 (F-box and WD repeat domain-containing7,FBW7) is a member of the F-box protein family, which is a substrate-recognizing protein molecule in the SF-type ubiquitin ligase complex and mediates the ubiquitin degradation of a variety of proteins in cells. FBW7 is a cancer suppressor protein. The degradation of cell proliferation, differentiation, cycle and apoptosis-related proteins is involved in many biological processes of tumorigenesis and development by regulating cell proliferation, differentiation, cycle and apoptosis-related protein degradation. Our previous studies showed that FBW7 was expressed differently in Gefitinib-sensitive parent cells and corresponding drug-resistant cells, and the expression of FBW7 decreased after drug-resistance. We will investigate the molecular mechanism of FBW7 regulating the sensitivity of Gefitinib and explore the strategies for reversing Gefitinib resistance by targeting FBW7. Methods: 1. PC-9 parent cells were treated with Gefitinib from 10 nM and the concentration of Gefitinib was doubled every 2 weeks. After 6 months of continuous culture, PC-9GR,EGFR gene sequencing and FISH were used to detect the presence of T790M and Met amplification in PC-9GR cells. (2) the expression of FBW7 in parental cells and drug-resistant cells at mRNA and protein levels were compared by PCR and Western blot methods, and the expression of PC-9 and HCC827 FBW7 in parental cells was down-regulated by shRNA to observe the presence of Gefitinib resistance. 4. To clarify the molecular mechanism of FBW7 regulating Gefitinib sensitivity and to explore the role of Bcl-2 family anti-apoptotic protein Mcl-1 in this process. Results: (1) T790M and Met genes were not detected by PC-9GR assay, and T790M and Met genes were not detected by FISH. (2) the expression level of FBW7 in parental cells was higher than that in the corresponding drug-resistant cells in both mRNA and protein levels. PCR and Western blot confirmed the down-regulation efficiency of FBW7. MTT, flow cytometry and Western blot showed that the sensitivity of parental cells to Gefitinib was decreased after down-regulation of FBW7 expression, and the drug-resistant phenotype of the cells was observed. 4. The differential expression of Bcl-2 family proteins existed between parental cells and drug-resistant cells, among which the difference of Mcl-1 was the most significant. FBW7 affected the sensitivity of cells to Gefitinib by degrading anti-apoptotic protein Mcl-1 and regulating the half-life of Mcl-1. Conclusion: 1 the expression level of FBW7 in PC-9 and HCC827 parent cells is higher than that in PC-9GR and HCC827GR5,HCC827GR6, cells, and there is no known mechanism of T790M and Met amplification in PC-9GR, suggesting that down-regulation of FBW7 expression may be a new mechanism of Gefitinib drug resistance. 2. Down-regulated the expression of FBW7, decreased the sensitivity of PC-9 and HCC827 to Gefitinib, increased the number of Gefitinib IC50 and decreased the percentage of cell apoptosis, speculated that the down-regulation of FBW7 expression might stabilize the anti-apoptotic molecules, but the expression of anti-apoptotic molecules did not decrease under the stimulation of apoptosis. In the end, parent cells were resistant to Gefitinib. 3. Down-regulation of FBW7 expression could stabilize anti-apoptosis protein Mcl-1, and decrease Mcl-1 degradation, and prolong the half-life of Mcl-1, which may be the key molecule leading to Gefitinib resistance.
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R734.2

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